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第一部分 B7-H3和SRSF3在结直肠癌中的表达及临床意义研究背景B7-H3作为重要的共抑制分子,在多种恶性肿瘤中异常高表达,与肿瘤的不良预后密切相关。此外,部分剪接因子在多种实体瘤中显著高表达。B7-H3在恶性肿瘤中的高表达可能与剪接因子的异常剪接有关。通过寻找影响B7-H3表达的调控因子,可为肿瘤的免疫治疗提供新的策略。本研究中,我们对结直肠癌进程中B7-H3的表达以及调控B7-H3剪接的剪接因子进行了研究。研究方法首先,利用肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库分析剪接因子与B7-H3的表达之间的相关性。设计合成剪接因子的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,并转染HCT-116细胞后,利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）技术测定B7-H3 mRNA的表达水平;从而筛选出调控B7-H3表达的剪接因子SRSF3。然后,使用人结肠癌及癌旁组织芯片（HcolH180su12）进行免疫组化染色及评分,检测B7-H3和SRSF3蛋白的表达差异;根据免疫组化评分将结直肠癌分成高低表达两组,利用统计学分析B7-H3和SRSF3的表达水平与患者临床病理特征及总生存期之间的关系。再随机选取12例结直肠癌组织及其配对癌旁组织,利用蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测B7-H3和SRSF3蛋白的表达水平。同时,我们还通过Western blot技术测定7种人结直肠癌细胞（HCT-116、HCT-8、Lovo、SW480、SW620、Caco-2 和 DLD-1）中 B7-H3 与 SRSF3 蛋白的表达水平;根据 B7-H3与SRSF3在结直肠癌组织及细胞中的表达水平,分析两者之间的相关性。此外,我们利用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）及Oncomine数据库分析B7-H3和SRSF3基因在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达差异。利用细胞克隆形成实验、Transwell实验分别检测SRSF3表达水平的高低对肠癌细胞增殖和迁移能力的影响。研究结果TCGA数据分析结果显示,肠癌组织中B7-H3表达与SF3A1、SF3A2、SF3B2、SF3B3、SF3B4、SRSF3、SRSF4、SRSF9等剪接因子表达显著相关。当敲低剪接因子SRSF3和SRSF8后,B7-H3 mRNA的表达水平明显下调,尤其是SRSF3 siRNA对B7-H3的表达影响最为明显。我们用免疫组化方法检测组织芯片中87对结肠癌及癌旁组织中SRSF3和B7-H3的表达,免疫组化染色及评分结果显示,B7-H3在43例肠癌组织的癌细胞胞浆中呈高表达,但在所有癌旁组织中低表达或无表达;SRSF3在52例肠癌组织的癌细胞胞浆、61例肠癌组织的细胞核和8例癌旁组织的细胞核中呈高表达,在其余癌组织和癌旁组织的细胞胞核中低表达或无表达。卡方检验分析结果表明,B7-H3表达与患者年龄显著相关（P=0.029）;SRSF3表达与肿瘤淋巴结转移和TNM分期显著相关,且与肿瘤细胞中B7-H3、p53和Ki67的表达显著正相关（P＜0.05）。单因素COX回归分析结果显示,B7-H3的表达、肿瘤分级、淋巴结转移、TNM分期、MSH6和MSH2的表达等与患者总体生存期显著相关。多因素COX回归分析结果发现,肿瘤分级、MSH6和MSH2为影响患者总体生存期的独立显著因素。生存曲线分析显示,B7-H3和SRSF3的高表达预示结直肠癌患者生存率较低。提取12例结直肠癌组织及癌旁组织中的蛋白;WB技术检测结果显示,与正常组织相比,B7-H3和SRSF3蛋白在结直肠癌中的表达明显上调。而且,在结直肠癌组织和细胞中,B7-H3与SRSF3的表达均呈正相关关系。此外,GEO及Oncomine数据库分析显示,B7-H3和SRSF3基因在结直肠癌中的表达均明显高于正常组织。细胞克隆形成实验、Transwell实验观察到,过表达SRSF3能显著增强肠癌细胞的增殖、迁移能力。研究结论B7-H3和SRSF3在结直肠癌组织及细胞系中均高表达,且两者表达呈正相关。B7-H3和SRSF3高表达与结直肠癌患者不良预后正相关,有可能作为预测结直肠癌患者预后的重要标志物,细胞实验表明SRSF3可促进肠癌细胞的增殖、迁移能力。第二部分 结直肠癌中SRSF3调控B7-H3剪接的机制研究研究背景SRSF3作为一种重要的选择性剪接因子,在结直肠癌组织中高表达,且SRSF3的表达与B7-H3的表达呈显著正相关,这一结果提示SRSF3可能参与了 B7-H3的选择性剪接。本研究中,我们对SRSF3调控B7-H3的剪接机制进行了研究。研究方法培养结直肠癌HCT-116和HCT-8细胞株,用siRNA和过表达SRSF3质粒载体转染HCT-116和HCT-8细胞,利用PCR和WB技术检测B7-H3 mRNA和蛋白的表达水平。采用RNA结合蛋白免疫共沉淀实验测定结直肠癌细胞内SRSF3蛋白与B7-H3 mRNA的结合情况。构建minigene重组质粒,并应用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）技术检测其转录本的长度。将minigene载体和SRSF3 siRNA或Flag-SRSF3质粒载体共转染HCT-116细胞以探究SRSF3对B7-H3 mRNA剪接调控,利用qRT-PCR技术检测HCT-116细胞中的minigene转录本表达情况。研究结果PCR和WB技术检测B7-H3 mRNA和蛋白的表达水平,结果发现敲低HCT-116和HCT-8细胞中SRSF3表达后,B7-H3的表达受到明显抑制（P＜0.05）;相反地,过表达SRSF3则能显著上调B7-H3的表达（P＜0.05）。RNA免疫共沉淀实验结果显示,SRSF3蛋白和B7-H3 mRNA均被磁珠/SRSF3抗体特异性拉下,表明剪接因子SRSF3蛋白可与B7-H3 mRNA直接结合。将含有外显子3-6和100bp侧翼序列的DNA片段克隆到pcDNA3.1（+）载体中,成功地构建了 minigene重组质粒。qRT-PCR检测结果显示,minigene重组质粒在HCT-116细胞中表达5种转录本,包括4和/或5外显子的跳跃和3或5内含子的保留。DNA测序进一步确定了每个转录本的序列。SRSF3基因敲低后,minigene的472-bp和404-bp产物的数量减少;而过表达SRSF3基因后,472-bp和404-bp产物的数量增加。研究结论在结直肠癌中,剪接因子SRSF3直接与B7-H3的外显子4和/或6结合,参与调控B7-H3的剪接。为了解B7-H3表达的调控机制以及结直肠癌治疗的潜在策略提供了新的可能。