肺癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤,在我国肺癌已成为发病率及死亡率排名第一的恶性肿瘤,其中小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)在肺癌中所占的比例约为15%。小细胞肺癌具有高侵袭性、高复发性及生长迅速的生物学特点,大多数小细胞肺癌诊断时已为广泛期,局限期仅占1/3,局限期和广泛期小细胞肺癌5年生存率仅为10%和2%。近40年来,小细胞肺癌的治疗并未取得明显的进展,目前铂类联合依托泊苷的化疗方案仍是小细胞肺癌的一线治疗选择,大多数患者在治疗后1年内复发或进展,这些患者进一步治疗后的中位生存时间只有4-5个月。如何提高小细胞肺癌治疗效果是人类健康研究亟待解决的重要研究课题。主要由于小细胞肺癌分子机制的研究尚不清晰。因此明确小细胞肺癌疾病发生及发展的分子机制是目前小细胞肺癌研究的重点。我们从癌基因异常表达分析入手,明确小细胞肺癌的分子病理机制,以探索更加合适的靶点,将可能为小细胞肺癌的治疗带来突破性进展。研究背景:弗里德白血病病毒插入位点1(Friend leukemia virus integration 1,FLI1)属于Ets(E26 transformation-specific)家族的转录因子,最早由Ben-David等在Friend病毒诱导的小鼠红白血病细胞中发现。通常情况下,FLI1主要存在于造血系统、血管内皮细胞及纤维母细胞中,此后通过研究证实FLI1可在多种血液系统恶性肿瘤的发生过程中发挥始动基因的作用。促癌基因FLI1可以通过特异性序列结合多种基因的启动子或增强子从而调控靶基因的转录活性,例如Bcl-2,而发挥促癌作用。近年来,随着对FLI1研究的深入,越来越多的研究显示FLI1在尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma,EWS)、恶性黑色素瘤(metastatic melanomas)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)、转移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)、子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)等多种实体肿瘤中亦存在异常高表达,且与上述肿瘤的发生发展密切相关。目前我们研究团队已证实FLI1在小细胞肺癌组织中异常高表达,且与小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡及克隆形成能力等恶性表型密切相关。近年来,随着RNA二代测序的进展,circRNA这一特殊的非编码RNA分子受到越来越多研究者们的关注。与线性RNA不同,circRNA分子呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达稳定且不易降解。最近研究报道circRNA分子富含miRNA结合位点,在细胞中起到miRNA海绵的作用,能阻断或降低miRNA对基因的抑制作用,从而调控靶基因的表达;同时还具有调控基因转录的潜能。我们通过前期数据库调研发现FLI1基因存在6种circRNAs形式,进一步通过对不同种肺癌细胞系及肺癌组织的检测发现有两种FLI1环状RNA(circFLI1)形式,即由FLI1外显子234形成的circRNA(circFLI1 E2-4)及由FLI1外显子2345形成的circRNA(circFLI1 E2-5),在小细胞肺癌组织及细胞系中的表达丰度显著高于非小细胞肺癌,但其在小细胞肺癌细胞中是否存在一定功能及其具体作用机制如何仍需进一步研究证实。研究目的:1.检测circFLI1在不同肺癌细胞及组织中的表达丰度。2.分析circFLI1与小细胞肺癌临床特征的相关性。3.全面评估circFLI1在小细胞肺癌发生发展中所发挥的生物学功能。4.探讨circFLI1促癌的分子机制,揭示circFLI1参与调控的信号通路以及下游靶基因。研究方法:通过实时定量荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-PCR)及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测的方法检测circFLI1在不同肺癌细胞及组织中的表达丰度,特别是在小细胞肺癌中的表达情况,统计学方法分析circFLI1与小细胞肺癌临床特征的相关性。通过sh RNA稳定干涉circFLI1的表达,并应用MTT、细胞计数法、流式细胞仪、Annexin V/7-AAD染色、Transwell和平板克隆形成实验评估circFLI1对细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移及克隆形成能力的影响。并通过裸鼠肺转移模型对circFLI1s在肿瘤转移中的作用进行进一步的体内实验验证。应用荧光素酶活性测试、western blot、RT-PCR、FISH检测及用逆转录相关捕获法(reverse transcription associated trap assay,RAT)等方法对分子机制进行探讨。研究结果:1.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5在小细胞肺癌细胞系及组织中的表达丰度较高,并且circFLI1 E2-4及circFLI1 E2-5的表达水平与小细胞肺癌的淋巴结转移情况呈正相关。2.Circ FLI1 E2-4在小细胞肺癌患者血清中的表达丰度较健康人群明显升高,且可在化疗后疾病缓解情况下表达丰度明显降低,有望成为小细胞肺癌患者治疗的生物学标志物。3.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5对小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡、细胞周期及克隆形成能力无明显影响,而小细胞肺癌细胞的转移能力有明显影响,敲低上述两种circFLI1可明显抑制小细胞肺癌细胞的转移能力。4.敲低circFLI1 E2-4可明显增强小细胞肺癌细胞对化疗药物依托泊苷(VP-16)的敏感性,而敲低circFLI1 E2-5则无上述效应。5.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5可与miR-584-3p结合。6.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5并进一步影响miR-584-3p下游ROCK蛋白的表达,从而间接调控Rho A/ROCK信号通路,导致小细胞肺癌细胞转移的发生。研究结论:本项目通过于组织水平、细胞水平和分子水平上完成了对circFLI1功能及作用机制的研究,揭示了circFLI1在小细胞肺癌转移及药物耐药方面所发挥的功能。并进一步探讨了circFLI1参与调控的信号通路,阐明了circFLI1通过直接与miR-584-3p的相互作用抑制其活性,调控miR-584-3p下游靶基因的转录,进而参与调控Rho A/ROCK1信号通路。本研究揭示了新的小细胞肺癌转移及药物耐药新的分子机制,并为Rho A/ROCK1信号通路的完整研究提供了有力的新线索。