物种在进化过程中一直伴随着基因组序列的变异,而基因组序列的变异又是物种进化的源动力。小麦是异源六倍体作物,在形成过程中因“杂合性”和“多倍性”引起的基因组冲击使小麦基因组发生了高频率的基因组变异,使多倍体“二倍体化”。本实验室利用非对称体细胞杂交方法获得了普通小麦(Triticum aestivum L.2n=42)济南177(JN177)与长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum,2n=70)的渐渗系小麦耐盐、抗旱和优质新品种山融3号(SR3)。非对称体细胞杂交过程中会发生双亲基因组短暂共存于一个细胞核、供体染色质大规模消减和少量供体染色质渐渗到受体基因组等事件,因而是一种特殊的二倍体化,也能引起强烈的基因组冲击,并产生系统性的基因组变异。但至今非对称杂交介导的基因组变异特征和机制及其和异源多倍体化的差异还未见报道。本实验室分子标记和功能基因分析显示,SR3基因组发生了遗传学和表观遗传学变异,但变异程度和特征仍不清楚。本试验拟构建SR3和亲本小麦JN177的cDNA文库并进行大规模测序,通过EST功能注释、EST序列分析和cDNA芯片杂交,从组学水平系统分析非对称体细胞杂交对SR3基因组的基因结构和基因表达的影响及其与SR3耐盐能力的关系,为阐明非对称杂交介导的基因组变异机制提供了理论基础。一、SR3和JN177cDNA文库构建现在常用的文库构建技术具有各自的优缺点。根据课题研究目标,本试验利用Stratagene技术构建了两个噬菌体文库：SR3盐胁迫根叶混合文库和SR3旱胁迫根叶混合文库；利用Gateway技术构建了两个重组文库：SR3盐旱胁迫根混合文库和JN177盐旱胁迫根混合文库。四个cDNA文库容量均达到107以上,插入片段的平均长度超过1.3kb,满足大规模测序的需要,为系统分析非对称杂交介导的基因组变异和深入开展小麦功能基因学研究提供了坚实的基础。二、SR3和JN177cDNA文库的大规模测序和注释利用5’端测序方法,获得了18192条SR3和9770条JN177的高质量5’端EST序列,总长度分别达到11678320 bp和7131983 bp。经CAP3软件聚类分析,分别获得了9634和7107条不重复的单一EST序列,其中contigs分别为2097和1207条,sigletons分别为7537和5900条,全长序列分别为4825条和2975条。利用本地BLAST软件将这些单一EST序列和小麦EST数据库进行比较,发现没有比对结果的476条SR3序列和594条JN177序列是新的小麦EST,而且部分SR3序列可能是来源于长穗偃麦草的外源序列。利用Blast2GO工具获得的单一EST序列进行功能注释和分类,发现在SR3 cDNA文库中含有高丰度的抗逆和抗病相关EST。利用codonw软件对SR3和JN177的密码子使用偏爱性进行了分析,结果表明SR3和JN177 EST密码子第三位GC含量分别为67.4%和69.7%,远远高于小麦基因整体序列的GC含量,而且SR3整体序列的GC含量明显低于JN177。三、SR3和JN177的EST序列多态性分析为了系统分析小麦品种间序列多态性和非对称杂交介导的序列多态性,本试验进行了三组比对分析：JN177 EST序列比对小麦EST数据库(JN177-Ta)、SR3EST序列比对小麦EST数据库(SR3-Ta)和SR3 EST序列比对JN177 EST序列(SR3-JN177)。然后从中提取相似性大于等于96%的序列进行多态性分析,其中SR3-JN177有2581条,SR3-Ta有7284条,JN177-Ta有5072条。与Ta数据库相比,JN177 EST序列的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)和1-22核苷酸插入/缺失(Insertion and Deletion, InDel)频率分别为9.02SNPs/kb EST和3.81InDels/kb EST, SR3 EST序列的SNPs和InDels频率分别为9.09 SNPs/kb EST和4.29 InDels/kb EST;而与JN 177相比,SR3 EST序列的SNPs和InDels频率较高,分别为11.8 SNPs/kb EST和5.44 InDels/kb EST。这些结果表明非对称体细胞杂交可以引起高频率的基因组变异；SR3-Ta间的基因组多态性并非是非对称体细胞杂交过程新产生的多态性和JN177-Ta间原有多态性的简单叠加,暗示基因组变异可能存在可逆的恢复变异机制,而且SNPs的恢复能力更强。结果发现,不同类型SNP和InDel的发生频率具有不均衡的特点。与JN177-Ta和SR3-Ta相比,SR3-JN177中A→T和T→A在总SNPs中所占比例明显降低,而C→T所占比例则显著提高(16.6%：14.8%)。C→T的碱基替换主要通过甲基化C脱氨实现,显示非对称体细胞杂交显著改变了SR3基因组的甲基化水平。SR3-Ta和JN177-Ta之间不同类型SNP所占比例也不相同,其中G→A频率在SR3-Ta SNPs中占17%,而在JN177-Ta只占14%,表明不同SNP的可逆性存在差异。SR3-JN177中单核苷酸Insertion频率占单核苷酸InDel的62.0%,JN177-Ta中占74.6%,而SR3-Ta中占76.4%,表明Insertion和Deletion的不均衡性导致InDel的可逆性程度较低,而且非对称体细胞杂交介导的Insertion和Deletion频率的均衡性高于自然和异源多倍体进化。JN177-Ta和SR3-Ta中大片段(>22bp)Deletion频率高于Insertion频率,表明异源六倍体小麦中的二倍体化是一直发生着的进化事件。但SR3-JN177中大片段Insertion频率高于Deletion频率,暗示非对称体细胞杂交杂种和异源多倍体中“二倍化”的机制存在显著差异。分析显示,InDel相邻核苷酸的GC含量具有特异性。JN177-Ta和SR3-Ta中Insertion左边相邻核苷酸GC含量很高而右边相邻核苷酸GC含量很低,Deletion正好相反；在SR3-JN177中Insertion和Deletion均为左边相邻核苷酸GC含量较高,而右边相邻核苷酸GC含量较低。这说明InDel不是一种随机的生物学事件,GC含量可能是InDel位点的识别特征,而且非对称体细胞杂交杂种和异源多倍体中的识别机制存在差异。有趣的是,我们发现6-22nt InDel具有“3N”特征,即6、9、12、15、18和21nt InDel频率及其侧翼序列GC含量均高于相邻大小InDel,而且InDel频率与侧翼序列GC含量存在指数相关性,其中SR3-JN1 77中相关性最高。此外,SR3-JN177中有些InDel两端具有重复序列的拷贝或者存在滑动现象,而且有些序列存在转位和反向重复等特征,表明非对称体细胞杂交能够引起多样化的基因组变异。四、SR3和.JN177的cDNA芯片分析为了评估高频率的基因组变异对转录组的影响以及SR3的耐逆分子基础,我们利用cDNA芯片比较了对照和盐、旱胁迫下SR3和JN177幼苗根转录组差异。为了涵盖部分渐渗到SR3中的长穗偃麦草序列,本试验根据部分cDNA文库序列和功能数据库小麦EST拼接序列设计探针,点制了60-mer cDNA芯片,其包含15172个探针,代表小麦15000个unigene。对照条件下,共有508个探针的转录水平在SR3和JN177间存在显著差异,其中在SR3中高表达的探针有241个,低表达的探针有267个。高表达探针中胁迫响应过程的富集程度最高,包括冷调节蛋白、热激蛋白和脱水素等。此外,戊糖磷酸和抗坏血酸盐代谢以及一些茉莉酸和赤霉素合成和响应途径基因表达显著增强,而碳和能量代谢相关基因表达降低。NaCl处理0.5h后,SR3和JN177中上调表达的探针分别有122和87个,其中48个共同上调；下调表达的探针分别为101和218个,其中75个共同下调。PEG处理0.5h后,SR3和JN177中上调表达的探针分别为215和210个,下调表达的探针分别为81和143个,其中同时上调和下调的探针分别为71和29个。NaCl处理24h后,SR3和JN177上调表达的探针分别为1451和1556个,下调表达的探针分别为1579和1507个,其中同时上调和下调的探针分别为950和978个有趣的是,除了4个探针外,其他非共同响应的探针均表现出品种特异性的胁迫响应特征,即在胁迫条件下只在一个品种中表达发生变化,而在另一个品种中表达量保持不变。生物途径聚类分析显示,PEG和NaCl胁迫0.5h后,SR3中非饱和脂肪酸和脂肪生物合成即α-亚麻酸代谢耐逆相关过程的活性显著高于JN177；NaCl处理24h后,抗坏血酸代谢、糖酵解／糖异生、不饱和脂肪酸和类黄酮生物合成等耐逆相关过程在SR3中被显著促进。这些途径增强与G蛋白—磷脂—ABA/DREB信号通路活性以及激素合成和调控网络的整体提升相关。将SR3与JN177 EST序列与芯片探针序列进行比对,具有匹配探针的EST序列分别有3471和1618条,但这些序列丰度与匹配探针的杂交信号间没有相关性。为了比较序列变异对基因表达的影响,我们从这些序列中提取出SR3和JN177同源且匹配探针表达变化的序列61条。上调表达探针匹配的序列共有17条,均具有SNPs,其中15条含有InDel,包括一个414bp的大片段InDel。下调表达探针匹配的序列有42条,其中39条具有SNPs,27条含有InDel。根据EST多态性分析和探针功能注释结果,发现SR3和JN177间基因表达差异是以下遗传学和表观遗传学因素系统改变的结果：1、序列发生了高频率的SNP和InDel变异；2、来源于供体亲本长穗偃麦草的渐渗序列：3、逆转录转座子和转座子转录活性的改变；4、一系列组蛋白变体和组蛋白修饰相关基因表达模式的转变导致染色体重塑；5、DNA甲基化模式的改变。综上,通过对SR3和JN177cDNA文库的高通量测序、序列比较和cDNA芯片分析表明,非对称体细胞杂交过程中基因组发生了有规律的高频率序列变异和表达变异,从而改变了SR3耐逆能力和发育潜力；非对称体细胞杂交与异源多倍体化和自然进化中的基因组变异存在明显的区别。本实验对这些变异规律的研究在一定程度上为理解非对称体细胞杂交和耐盐的机制提供了重要信息。