论文部分内容阅读
环核苷酸磷酸二酯酶八型(PDE8)是环核苷酸磷酸二酯酶家族中cAMP底物特异性的同工酶之一，在多种生理过程中起重要作用，并与肾上腺皮质增生等疾病有关。由于大量制备纯化PDE8十分困难，目前尚无文献报道PDE8催化结构域的晶体结构。为了深入揭示PDE8的催化水解机理及其与抑制剂之间的相互作用，本文经过系统性研究，首次成功地在E.coli中过表达出变性PDE8A1催化结构域片段(氨基酸序列480-820)，并用直接稀释法复性，得到大量高活性、纯度大于95％的PDE8A1(480-820)；用酶促反应动力学表征复性出的PDE8A催化结构域片段；获得了三个蛋白质晶体并通过X射线衍射测定其结构。三个蛋白质晶体及其分辨率分别为：PDE8A1(480-820)晶体(分辨率为1.9A)、PDE8A1(480-820)-IBMX复合物晶体(分辨率为2.1A)、PDE8A1(480-820)-Dipyridamole复合物晶体(分辨率为1.95A)。
通过酶促反应动力学对复性PDE8A1(480-820)进行表征，发现以cAMP为底物，在含有10mMMgCl2的缓冲液中，复性PDE8A1(480-820)的KM为7.0±0.1μM，kcat为2.9±0.1s-1；在含有4mMMnCl2的缓冲液中，其KM为1.8±0.1μM，kcat为4.0±0.1s-1。复性PDE8A1(480-820)与文献报道全长PDE8A1相比，其KM为后者的7-45倍。用同样的方法复性PDE8A1(205-820)并测得其KM为0.28μM，因此推测PDE8A1的N端PAS结构域可能对PDE8A1的催化活性起调节作用。本文还测定了IBMX和Dipyridamole对复性PDE8A1(480-820)的IC50分别为698±29μM和6.0±0.4μM。
从晶体结构中发现：PDE8A1催化结构域由18个α螺旋组成，并含有两个金属离子，其整体结构与其它已知的PDE同工酶催化结构域极为相似。本文由复性PDE8A1(480-820)的结构出发，结合酶促反应动力学研究和已有的文献报道，对PDE8A1催化结构域的催化水解机理进行了推测。与其它已知的PDE同工酶催化结构域晶体结构进行对比，发现PDE8A1Gln778的构象未直接被其它氨基酸残基所固定，而是分别通过两个水分子与Ser745和Trp813连接，其构象比其它PDE同工酶中相应位置的谷氨酰胺残基的自由度高，并且在不同条件下Gln778的构象可能有所差异。本文还详细研究了复性PDE8A1(480-820)与IBMX的相互作用。结果表明Tyr748阻碍了IBMX与PDE8A1的结合。在Y748F定点突变后另外十一种抑制剂对PDE8A1(480-820)抑制能力变化较大，所以Tyr748在其它抑制剂与PDE8A1的结合中也有重要作用。