研究目的白介素-37(IL-37)是新发现的免疫负调控分子,它有5个亚型IL-37a-e,其中IL-37b是目前研究最多的,也是公认的有功能的亚型,它作为抑制炎症的分子,在很多疾病中都发挥重要的功能,例如,在内毒素性休克、结肠炎、脊髓损伤、类风湿性关节炎等炎症性疾病模型中,IL-37b都对机体有保护作用。IL-37b发挥生物学功能主要依靠其C-端3个外显子4、5、6形成有功能的β折叠结构,通过对IL-37其他亚型的基因结构分析发现,IL-37a和IL-37d同样具有外显子4、5、6,推测这两个亚型也是具有功能的,而IL-37d比IL-37b仅缺少了一个外显子2,但目前对于IL-37d的功能还没有研究报道。为了进一步探究IL-37d的生物学功能,我们实验室构建了 IL-37d转基因小鼠,初步在内毒素血症模型证明IL-37d与IL-37b一样具有抗炎作用,但在其他疾病中的作用和作用机制尚不清楚。近几年的研究报道表明炎症小体在多种疾病的发生发展中发挥重要作用,特别是NLRP3炎症小体,它的过度活化会加重多种疾病的严重程度,如2型糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖病和结肠炎等。那么IL-37d是否可通过调控NLRP3炎症小体进而抑制炎性疾病的发生?如果可以,它的作用机制如何?这些问题尚不清楚。本研究的目的就是探索IL-37d对NLRP3炎症小体的调控及其机制;并利用转基因小鼠,以DSS-结肠炎为模型探讨了 IL-37d在炎性疾病中的作用。研究方法一、体外实验证明IL-37d对NLRP3炎症小体的影响1.取野生型小鼠和IL-37d转基因小鼠的腹腔巨噬细胞,用LPS和ATP刺激活化NLRP3炎症小体,用荧光定量PCR检测IL-37表达对IL-1β和IL-6的mRNA表达的影响,ELISA的方法检测IL-37表达对上清中IL-1β和IL-6分泌情况的影响,Western-blot检测其对IL-1β蛋白表达的影响。2.取野生型小鼠和IL-37d转基因小鼠的腹腔巨噬细胞,用LPS和ATP刺激活化NLRP3炎症小体,荧光定量PCR检测IL-37d表达对NLRP3、caspase1、ASC各个组分mRNA水平表达的影响;Western-blot检测炎症小体NLRP3、pro-caspase1、ASC、caspase1p10各个组分蛋白水平的变化情况。二、体内实验证明IL-37d对NLRP3炎症小体的影响1.急性腹膜炎模型:向野生型小鼠和IL-37d转基因小鼠的腹腔中注射明矾700μg,12h后用PBS收取小鼠腹腔灌洗液,计数统计腹腔灌洗液中的细胞总数;流式细胞术检测灌洗液中中性粒细胞和单核细胞的数量。2.急性结肠炎模型:向野生型小鼠和IL-37d转基因小鼠喂食4%葡聚糖硫酸钠溶液7天,期间每日称重,取小鼠粪便做大便潜血实验,7日后,将小鼠摘除眼球取血,结肠拍照,体外定量培养结肠组织,收集上清,石蜡包埋结肠组织用于HE染色和免疫组织化学染色。三、IL-37d调控NLRP3炎症小体活性的机制(一)IL-37d转基因小鼠中IL-37d发挥作用的形式1.取野生型小鼠和IL-37d转基因小鼠的腹腔巨噬细胞,用LPS和ATP刺激,浓缩上清,western-blot检测IL-37d分泌的形式。(二)IL-37d对NLRP3炎症小体活性调控是否依赖于受体介导通路1.外源性重组IL-37d蛋白是否可抑制NLRP3的活化及沉默IL-37受体后对炎症小体活化的影响。(1)原核表达IL-37d重组蛋白,纯化蛋白后去内毒素。(2)取野生型小鼠的腹腔巨噬细胞,加入IL-37d重组蛋白,用LPS和ATP刺激,ELISA检测上清中IL-1β的分泌情况,western-blot检测NLRP3炎症小体各个组分的蛋白水平。(3)取野生型小鼠的腹腔巨噬细胞,转染IL-37d受体SIGIRR的小干扰,加入IL-37d重组蛋白,ELISA检测上清中IL-1β的分泌情况,western-blot检测NLRP3炎症小体各个组分的蛋白水平。四、IL-37d调控NLRP3活性的信号通路1.取野生型小鼠和IL-37d转基因小鼠的腹腔巨噬细胞,用LPS和ATP刺激Western-blot检测NF-κB信号通路的改变。2.取野生型小鼠的腹腔巨噬细胞,加入IL-37d重组蛋白,用LPS和ATP刺激,Western-blot检测NF-κB信号通路的改变。结果一、IL-37d能够下调NLRP3炎症小体活化条件下IL-1β的分泌为了分析IL-37d对NLRP3炎症小体的影响,我们分别取野生型和IL-37d转基因小鼠腹腔巨噬细胞,体外用LPS和LPS+ATP活化炎症小体,荧光定量PCR、Western Blot和ELISA的方法分析IL-37d对NLRP3炎症小体活化条件下IL-1β表达的影响,同时以IL-6作为对照。结果显示IL-37d能抑制LPS刺激后IL-6mRNA的表达水平,ATP的加入没有进一步影响其表达水平。但是不管在LPS刺激还是LPS+ATP调节下,IL-37d对IL-1β的mRNA水平均无明显影响并且Western-blot结果显示IL-37d对IL-1β前体的表达也无明显影响。然而ELISA结果显示,在加入LPS刺激时,IL-37d转基因小鼠腹腔巨噬细胞上清中IL-1β的分泌与野生型小鼠差别不大,且分泌量都很低;但在同时加入LPS和NLRP3炎症小体激动剂ATP后,IL-37d转基因小鼠腹腔巨噬细胞上清中IL-1β的分泌明显少于野生型小鼠。我们同时还检测了 IL-6的分泌,因为IL-6的分泌并不依赖于炎症小体的活化,所以IL-37d对IL-6的抑制作用并没有随着NLRP3炎症小体激动剂ATP的加入而改变。这些结果证明IL-37d对IL-1β的抑制是通过调控NLRP3炎症小体的活性。二、IL-37d下调NLRP3炎症小体组分NLRP3的表达为了进一步研究IL-37d对NLRP3炎症小体的影响,我们用荧光定量PCR和Western Blot的方法进一步分析了 IL-37d对NLRP3炎症小体各组分的影响。结果显示,IL-37d可明显下调NLRP3的mRNA的表达,但对其他组分影响不大。进一步Western-blot结果显示,在LPS刺激时,IL-37d转基因小鼠腹腔巨噬细胞中的NLRP3蛋白表达量明显低于野生型小鼠,在LPS和ATP同时刺激时Caspase1的活性形式p10,也有降低的趋势,证明IL-37d对NLRP3炎症小体的活性有抑制作用,并提示IL-37d主要是通过抑制NLRP3表达进而抑制炎症小体的活化。三、IL-37d转基因小鼠抵抗炎症小体诱发的急性腹膜炎为了进一步确定IL-37d对炎症小体的活性的影响,我们利用转基因小鼠和明矾诱导的急性腹膜炎模型,在体内分析了 IL-37d对炎症小体的影响,我们发现IL-37d转基因小鼠腹腔灌洗液中的细胞总数、中性粒细胞数和单核细胞数都明显低于野生型,说明IL-37d可抑制炎症小体介导的急性腹膜炎。四、IL-37d转基因小鼠抵抗DSS诱导的炎症小体活化的急性结肠炎已知NLRP3炎症小体的过度活化参与急性结肠炎的发生和发展,为了确定IL-37d是否可通过抑制炎症小体的活化抑制结肠炎,我们利用转基因小鼠和DSS诱导的急性结肠炎模型,在体内分析了 IL-37d对炎症小体的影响及其对结肠炎的影响。结果显示在急性结肠炎模型中,IL-37d转基因小鼠的血清和肠培养物上清中的IL-1β相比于野生型小鼠都有下降的趋势,且血清中的差异有统计学意义。免疫组织化学结果显示,IL-37d转基因小鼠结肠组织NLRP3蛋白的表达量要少于野生型小鼠。同时,HE染色结果显示IL-37d改善DSS诱导的结肠黏膜的损伤、减少炎性细胞的浸润。结肠长度统计结果表明,IL-37d转基因小鼠的结肠比野生型小鼠的长,且有统计学意义。对急性结肠炎模型小鼠7天的体重下降百分数和疾病活跃指数进行统计,结果表明,IL-37d转基因小鼠体重下降百分数高于野生型小鼠,疾病活跃指数低于野生型,且都有统计学意义。上述结果说明IL-37d抑制炎症小体的过度活化及减轻结肠炎程度。五、IL-37d对NLRP3炎症小体的作用机制为了探究IL-37d对NLRP3炎症小体的作用机制,我们想先明确IL-37d发挥作用的形式。我们取IL-37d转基因小鼠的腹腔巨噬细胞,在LPS和ATP同时刺激的情况下,收集并浓缩其上清,western-blot结果显示,上清中包含IL-37d的成熟形式和前体形式。确定IL-37d在胞外发挥作用后,我们原核表达IL-37d,纯化蛋白后,用于体外实验。ELISA和western-blot结果显示,相比于不加重组蛋白的野生型小鼠的腹腔巨噬细胞,IL-37d重组蛋白可以抑制NLRP3炎症小体活化产生的IL-1β的分泌,同时也能够抑制NLRP3蛋白的表达及NF-κB的活性。结果提示IL-37d是通过胞膜受体依赖的方式发挥抑制作用。为了进一步确定IL-37d是通过受体介导的信号通路发挥作用,我们在野生型小鼠的腹腔巨噬细胞中转染IL-37d受体SIGIRR的小干扰,ELISA结果显示,沉默IL-37d受体表达后,IL-37d对IL-1β的抑制作用消失,western-blot的结果显示,IL-37d对NLRP3蛋白及NF-κB的抑制作用也消失。说明IL-37d对NLRP3炎症小体活性的抑制是通过受体介导的信号通路,抑制NLRP3蛋白的表达来实现的。结论1.IL-37d能够抑制NLRP3炎症小体的活性,从而可以下调由NLRP3炎症小体活化产生的促炎细胞因子IL-1β的分泌,进而缓解结肠炎。2.IL-37d对NLRP3炎症小体活性的抑制是通过受体介导的信号通路,抑制NLRP3蛋白的表达来实现的。创新性及意义1.本研究首次提出,IL-37d作为IL-37的一种亚型,是具有生物学功能的亚型,具有免疫抑制作用,能够抑制失控的炎症反应,从而缓解结肠炎,为治疗炎症性疾病提供了新的靶点。2.本研究还对IL-37d发挥抑制作用的机制做了阐述,它可以通过受体介导的信号通路,抑制NLRP3炎症小体的过度活化,从而抑制促炎细胞因子IL-1β的分泌。结合之前的文献报道,IL-37的成熟需要NLRP3炎症小体活化的caspasel切割,我们发现NLRP3炎症小体和IL-37d之间可以形成环路,这也是机体维持免疫平衡的表现。局限性1.本研究只是在转基因小鼠层面进行研究,并没有结合临床标本,想要将其应用到临床,还需要结合临床标本进一步研究。2.本研究IL-37d抑制炎症小体的详细机制还需要做更多的工作进一步确定其结论。