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目的:胃癌是世界范围内发病率较高的癌症之一,我国更是胃癌的高发地区之一。针对胃癌,化疗是传统治疗中的一种常用手段。在化疗中,化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡来杀死细胞。但是,由于耐药性的存在常常导致化疗失败。而铁死亡作为一种新型的铁依赖性脂质过氧化所致的非凋亡形式的细胞死亡,诱导肿瘤细胞发生铁死亡有望成为治疗肿瘤或逆转化疗药物的耐药性的新手段。巨核细胞白血病因子1(Megakaryocyte leukemia factor 1,MKL-1)作为细胞中重要的转录因子,在多种癌症中异常表达,其异常表达与肿瘤细胞的增殖,凋亡和自噬等生理活动密切相关。最近有研究显示,MKL-1会参与到调控细胞氧化应激的过程中,但是MKL-1是否参与到调控细胞铁死亡并不清楚。因此,本研究以铁死亡作为切入点,明确MKL-1调控铁死亡的分子机制及其表达对铁死亡诱导剂的影响。并在此基础上,开发以MKL-1为靶点的铁死亡治疗的抗肿瘤策略。为基于铁死亡的胃癌抗肿瘤治疗方案和药物靶点的开发提供相关理论和实验支持。材料和方法:利用R语言对数据库和测序数据进行生物信息学分析;利用免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC),实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR),酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白免疫印迹(Western Blot)检测细胞和肿瘤组织中目的基因或RNA的表达水平;利用慢病毒包装技术构建目的人胃癌细胞株;利用C11 BODIPY 581/591探针结合流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞和肿瘤组织中脂质活性氧(Lipid reactive oxygen species,Lipid ROS)的水平;利用丙二醛(Malondialdehyde,MDA)脂质氧化水平检测试剂盒检测细胞和肿瘤组织中膜脂过氧化产物MDA的水平;利用亚铁离子检测试剂盒检测细胞中Fe2+的浓度;利用谷胱甘肽(Glutathione,GSH)检测试剂盒检测细胞中GSH的水平;利用透射电子显微镜观察线粒体和外泌体的形态;利用荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)结合共聚焦显微镜检测目的RNA的表达和在细胞中的定位;染色质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Ch IP),RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)和双荧光素酶报告基因活力实验验证预测结合位点;利用细胞活力试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8),和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U)细胞增殖实验和克隆形成实验检测细胞的活力;利用裸鼠异种移植瘤模型检测肿瘤细胞的成瘤能力;利用纳米颗粒粒径分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)检测外泌体的直径大小。结果:(1)MKL-1负向调控铁死亡发生:通过生物信息发现MKL-1在TCGA数据库中和12例胃癌样本中的表达上调,并且高MKL-1表达组的总体生存率更差。通过使用不同的铁死亡诱导剂爱拉斯汀(Erastin),索拉非尼(Sorafenib),DPI7(ML162)和DPI10(ML210)成功建立了胃癌铁死亡应激模型。在胃癌铁死亡应激模型中,敲低MKL-1的表达显著增加细胞中Lipid ROS的积累和MDA的产生,并且这种现象并没有胃癌细胞特异性,而过表达MKL-1显著降低细胞中Lipid ROS的积累,防止胃癌细胞发生铁死亡。裸鼠异种移植瘤模型也显示出敲低MKL-1的表达显著增强Erastin的抗肿瘤效果。(2)MKL-1负向调控铁死亡发生的分子机制:从下游机制上来看,在Erastin诱导的铁死亡应激模型中,敲低MKL-1的表达通过降低细胞中GSH的水平促进胃癌细胞铁死亡的发生。外源性的补充GSH可以消除这种现象。进一步的研究显示,MKL-1靶向胱氨酸谷氨酸转运系统中溶质载体家族3成员2(Solute carrier family 3,member 2,SLC3A2)和溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7,member 11,SLC7A11)的启动子上的顺式作用元件(CAr G Box)促进其表达,从而影响GSH的合成,降低细胞中脂质过氧化水平,减少细胞铁死亡的发生。从上游机制上来看,mi R-149-5p通过靶向MKL-1 m RNA的3’UTR抑制其表达,并且MKL-1的反义lnc RNA MKL-1-AS1作为分子海绵通过竞争性结合削弱mi R-149-5p的抑制作用。同时,在Erastin诱导的铁死亡应激模型中,过表达mi R-149-5p和敲低MKL-1-AS1后都增加细胞中Lipid ROS的积累和MDA的产生,减少GSH的合成。(3)基于干预MKL-1的表达的抗肿瘤治疗方案:通过检测MSCs的标记物和分化能力鉴定MSCs的纯度,并通过MSCs制备一种过表达mi R-149-5p和包裹MKL-1 si RNA的具有治疗功能的外泌体。在经过该外泌体治疗后,不仅显著提高胃癌细胞中mi R-149-5p的表达,降低MKL-1的表达;同时降低胃癌细胞的增殖能力,增加细胞中Lipid ROS的积累。此外,裸鼠异种移植瘤模型显示出,裸鼠在经过该外泌体治疗后,皮下肿瘤的生长速度更慢,并显著增强Erastin的抗肿瘤效果。分离的裸鼠皮下肿瘤组织的结果也治疗组中MKL-1的表达和GSH更低,并且MKL-1的表达与SLC3A2和SLC7A11呈显著正相关,但和mi R-149-5p呈显著负相关。结论:本研究发现MKL-1是一个新的铁死亡的负向调控蛋白。从下游机制上来看,MKL-1通过与血清反应因子(Serum response factor,SRF)形成复合物,靶向System Xc系统中SLC3A2和SLC7A11的启动子上的CAr G Box促进其表达,增加肿瘤细胞中GSH的合成来减少铁死亡的发生。从上游来看,mi R-149-5p靶向MKL-1 m RNA的3’UTR抑制MKL-1的表达,MKL-1-AS1作为分子海绵竞争性结合mi R-149-5p削弱mi R-149-5p的抑制效果。通过MSCs制备一种过表达mi R-149-5p和包裹MKL-1 si RNA的具有治疗功能的外泌体。在经过该外泌体治疗后,可显著恢复胃癌细胞中mi R-149-5p的表达,抑制MKL-1的表达,并显著增强Erastin的抗肿瘤效果。