【摘 要】
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目的:借助UPLC-IT-TOF液质联用高分辨质谱分析技术、网络药理学、体外肿瘤细胞、体内荷瘤动物模型,系统探索黔产两种石斛抗肿瘤活性成分和抗肿瘤药理作用机制,为黔产两种石斛金钗石斛、铁皮石斛的新药开发和临床应用奠定坚实的药学基础。方法:1.采用MTT法检测金钗石斛和铁皮石斛提取物对人肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7和肝癌Hep G2细胞活力的影响,比色法分析A549细胞中葡萄糖消耗量和乳酸
【基金项目】
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贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑[2021]一般415）; 贵州省自然科学基金（黔科合基础[2020]1Y404）; 贵州省大学生创新创业训练计划项目（S202110660009,S202010660006）
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目的:借助UPLC-IT-TOF液质联用高分辨质谱分析技术、网络药理学、体外肿瘤细胞、体内荷瘤动物模型,系统探索黔产两种石斛抗肿瘤活性成分和抗肿瘤药理作用机制,为黔产两种石斛金钗石斛、铁皮石斛的新药开发和临床应用奠定坚实的药学基础。方法:1.采用MTT法检测金钗石斛和铁皮石斛提取物对人肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7和肝癌Hep G2细胞活力的影响,比色法分析A549细胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量,UPLC-IT-TOF分析金钗石斛和铁皮石斛抗肿瘤化学成分。2.利用Swiss Target Prediction和pharm Mapper Server数据库预测候选化合物的药物作用靶点,Geencard收集癌症靶点,Veen分析获取化合物和癌症交集靶点,STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络筛选抗肿瘤核心靶点,Cytoscape 3.7.2构建“草药-化合物-靶点”的网络图筛选出抗肿瘤关键化合物,DAVID数据库和微生信数据库进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析和可视化,分子对接分析抗肿瘤关键化合物与核心靶点的相互作用。3.建立LLC肺癌细胞荷瘤小鼠模型,记录和绘制口服灌胃给予金钗石斛和铁皮石斛提取物的肺癌荷瘤小鼠体重变化曲线和肿瘤瘤体生长曲线评价金钗石斛和铁皮石斛提取物对肺癌荷瘤小鼠的体内治疗作用。Western blotting检测金钗石斛和铁皮石斛提取物对PI3K-Akt和HIF-1α信号通路的影响以及糖酵解关键蛋白GLUT4和HK2蛋白表达水平,分子对接分析moscatin、densiflorol B、gigantol和moscatilin与HIF-1α、GLUT4和HK2相互作用。结果:1.金钗石斛提取物和铁皮石斛提取物能显著抑制人肺癌A549细胞、人肝癌Hep G2细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的增殖（p＜0.05）,且呈剂量依赖性,相同药物浓度下,铁皮石斛提取物的抗肿瘤作用强于金钗石斛提取物,通过UPLC-IT-TOF、LCMSsolution 3.81和Met ID 1.2软件,根据保留时间、精确分子质量、MSn碎片、标准品和天然产物数据库,鉴定了金钗石斛和铁皮石斛的40个化学成分,包括菲、联苄类和其他类型的化合物,具有良好抗肿瘤活性的菲类化合物主要存在于金钗石斛中,联苄类化合物是铁皮石斛的主要成分。2.草药-化合物-靶点-癌症网络图和文献调研显示gigantol、moscatin、tristin、moscatin和densiflorol B是金钗石斛抗肿瘤化合物,联苄类化合物是铁皮石斛抗肿瘤关键化合物,金钗石斛和铁皮石斛抗肿瘤核心靶点共有7个交集靶点,占抗肿瘤核心靶点的70%,金钗石斛和铁皮石斛超过一半的抗肿瘤KEGG通路相似,分子对接结果显示抗肿瘤核心化合物与核心靶点形成稳定构象,金钗石斛和铁皮石斛的抗肿瘤机制与PI3K-Akt和HIF-1α密切相关。3.金钗石斛和铁皮石斛提取物能够明显降低A549细胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量（P＜0.05）,皮下移植瘤小鼠体内实验结果表明:200和600mg/kg金钗石斛提取物以及200和400 mg/kg铁皮石斛提取物在不引起小鼠体重变化的情况下能抑制肺癌皮下移植瘤瘤体生长,蛋白质印迹实验结果表明,金钗石斛和铁皮石斛提取物抑制PI3K-Akt和HIF-1α信号通路,进而下调A549细胞和小鼠肺癌肿瘤组织中GLUT4和HK2表达（P＜0.05）,moscatin、densiflorol B、gigantol和moscatilin凭借氢键、π-π共轭和疏水作用与GLUT4和HK2发挥相互作用。结论:本研究首次建立了一种高效灵敏的UPLC-IT-TOF、网络药理学和体内外实验策略,用于快速探索和比较金钗石斛和铁皮石斛的抗肿瘤化合物和作用机制,共鉴定出40个潜在抗肿瘤化合物,gigantol、moscatin、tristin、moscatin和densiflorol B是金钗石斛抗肿瘤关键化合物,联苄类化合物是铁皮石斛的关键抗肿瘤化合物,金钗石斛和铁皮石斛在抗肿瘤核心靶点和KEGG通路存在相似性,下调A549细胞PI3K-Akt和HIF-1α信号通路,影响糖酵解途径的GLUT4和HK2的蛋白表达,抑制肿瘤糖酵解发挥其体内外抗肺癌的治疗作用。这些发现展示更清晰的金钗石斛和铁皮石斛抗肿瘤物质基础,指导金钗石斛和铁皮石斛进一步的药理机制研究。
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