背景：急性缺血性卒中因具有发病率高、致残率高、病死率高及神经功能损伤的难治性等特点,倍受国内外学者关注。溶栓治疗是目前唯一被循证医学证实的治疗急性脑梗死的有效方法,其从上世纪90年代开始,经过10多年的多国家多中心研究,已经有了很大的进展,但仍是国际上讨论的重点问题。溶栓尽管目前被认为是治疗急性缺血性卒中最有效的方法,但是容易引起出血转化等多种严重并发症,且有严格的时间窗限制,这些大大限制了其临床应用。经现代研究证实,血脑屏障通透性的增高和完整性的破坏是溶栓后出血转化的重要原因。紧密连接是保持血脑屏障完整性的重要因素,由跨膜蛋白和膜相关蛋白共同组成,其功能是将相邻两个细胞连接起来,封闭了细胞间的空隙,阻挡细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内并参与细胞生长分化的信号的传递等。分子生物学等研究证实,紧密连接是血脑屏障通透性调节的中心环节,Claudins是紧密连接的主要结构蛋白,其表达水平的变化与脑微血管通透性的改变及脑水肿的程度密切相关。黄芪与川芎是临床常配伍运用的益气活血药对,现代研究证明它们都能对血脑屏障产生显著的保护作用,但在对紧密连接的作用方面尚未见报道。本研究首先探讨了急性脑梗死大鼠溶栓后不同时点血脑屏障通透性的改变以及川芎嗪、黄芪注射液对血脑屏障通透性的影响,然后应用形态学、分子生物学等方法,证明川芎嗪、黄芪注射液对血脑屏障的保护作用的机制,为今后利用中药复方的多组分特点及采用中西医结合疗法来提高溶栓成功率、预防出血转化、扩大溶栓适用范围等方面的研究奠定基础。方法：1.溶栓用大鼠急性大脑中动脉栓塞模型的建立将大鼠麻醉,仰卧固定。取颈正中皮肤切口,钝性分离肌肉及皮下组织,暴露右侧颈总动脉,分离迷走神经,将颈总动脉钝性分离至暴露颈外动脉和颈内动脉分叉处。用注射器选大鼠易结扎止血的动脉处取动脉血0.1ml,吸入4U凝血酶,混匀静置10分钟,待血液凝固后将其注入24G静脉留置针管,制成长约lcm的栓子,后接1-2ml的生理盐水注射器。制作过程中注意勿使留置针管内进入空气。将留置针在颈外动脉和颈内动脉分叉的前方穿刺进颈总动脉,并向前内侧进入颈内动脉内10mm,拔出针芯,用吸有生理盐水的注射器快速将栓子冲入颈内动脉内,结扎颈总动脉并缝合肌肉及皮肤。2.实验大鼠给药及分组将大鼠随机分为假手术组、溶栓组、川芎组、黄芪组及联合治疗组。其中溶栓组、川芎组、黄芪组及联合治疗组又按不同处死时间点(溶栓后3、6、24小时)平均分组。除假手术组外各组均于造模3h后经股静脉给予rt-PA,假手术组给予等体积生理盐水。川芎组大鼠在造模后和溶栓后均立即腹腔注射川芎嗪注射液；黄芪组大鼠在造模后和溶栓后均立即腹腔注射黄芪注射液；联合组大鼠在造模后和溶栓后均立即腹腔注射川芎嗪注射液+黄芪注射液。3.利用伊文思兰的渗透性评估血脑屏障的通透性,透射电镜观察血脑屏障通透性的变化。4.透射电子显微镜观察内皮细胞紧密连接超微结构的变化。5.荧光免疫组化法测定缺血区脑组织血管内皮细胞紧密连接相关蛋白Claudin-1、Claudin-5的蛋白表达及分布。6. Western Blot法检测缺血区脑组织血管内皮细胞紧密连接相关蛋白Claudin-1、Claudin-5的蛋白量。结果：1.用我们改进的方法进行造模,大鼠在行为学、TTC染色及影像学方面均有明显缺血表现,脑梗死体积为(264.85±33.43)mm3,脑梗死体积率为(40.76±4.68)%,造模死亡率为6.7%。2.对不同时间点各组大鼠脑内EB含量比较：溶栓组大鼠脑内EB含量最高,且EB含量随时间延长不断增多。川芎嗪注射液和黄芪注射液分别可以在溶栓后3h内明显降低大鼠脑内EB含量,而川芎嗪注射液与黄芪注射液合用在溶栓后各时间点均可以明显降低EB含量,与其余各组相比差异显著。川芎组与黄芪组在各时间点相比差异均不显著。3.不同时间点各组大鼠血脑屏障通透性电镜下表现：假手术组可见高密度的硝酸镧颗粒散布于毛细血管腔及内壁,血管外无硝酸镧颗粒沉积。溶栓组毛细血管内皮细胞肿胀,基膜厚薄不均匀,内皮细胞核皱缩,血脑屏障开放,血管外脑组织水肿,硝酸镧颗粒通过毛细血管壁,大量沉积于血管内皮浆细胞内、内皮细胞膜上以及血管周围组织间隙,随时间推移漏出的硝酸镧颗粒逐渐增多。川芎组与黄芪组大鼠毛细血管内皮细胞肿胀,基膜厚薄不均匀,内皮细胞核皱缩,血脑屏障开放,血管外脑组织水肿,硝酸镧颗粒沉积于血管内皮细胞膜上以及血管周围组织间隙。联合治疗组毛细血管内皮细胞肿胀,基膜厚薄不均匀,内皮细胞核皱缩,硝酸镧颗分布于附着于毛细血管腔及内壁,血管外间隙有少量硝酸镧颗粒沉积。4.透射电子显微镜观察内皮细胞TJ超微结构的变化：假手术组大鼠的毛细血管内皮细胞无肿胀,基膜厚薄均匀,相邻内皮细胞间可见清晰的TJ,呈连续条带状,结构非常致密和完整。溶栓组大鼠毛细血管内皮细胞肿胀,基膜厚薄不均匀,TJ结构非常松散,随溶栓后时间的延长甚至出现断裂及消失。给予川芎嗪注射液、黄芪注射液干预后,川芎组及黄芪组大鼠毛细血管内皮细胞肿胀,基膜厚薄不均匀,大部分TJ出现结构松散,断裂情况不严重,无TJ消失。联合治疗组大鼠毛细血管内皮细胞出现肿胀,6h及24h组可见部分TJ结构出现松散,但3h组仍可见到结构完整的TJ。5. Claudin-1、Claudin-5的荧光免疫组化检测：在假手术组大鼠,TJ蛋白Claudin-1、Claudin-5均沿血管内皮正常表达。而在溶栓组,Claudin-1、Claudin-5的表达均较假手术组下调明显,且随时间的延长逐渐下降,在川芎、黄芪及联合治疗组,Claudin-1、Claudin-5的表达与溶栓组相比有显著改善。6. Claudin-1、Claudin-5的蛋白半定量检测：溶栓组大鼠脑内Claudin-1、Claudin-5含量最低,且随时间延长不断下降。川芎嗪注射液和黄芪注射液分别可以不同程度的提高溶栓后大鼠脑内Claudin-1及Claudin-5的含量,联合治疗组大鼠的Claudin-1及Claudin-5含量在各时间点较其他组都高,差异具有统计学意义。川芎组与黄芪组在各时间点相比差异均不显著。结论：经我们简化后的大鼠大脑中动脉栓塞模型,该模型栓塞效果明显且成功率高、重复性好,大大降低了手术难度,节约了研究时间及成本,若进行对梗死部位不过分要求的溶栓或局灶性脑缺血药物保护机制的研究,我们认为这种简单易行的血栓栓塞模型不失为首选。对急性缺血性卒中大鼠进行rt-PA溶栓治疗,随时间延长,血脑屏障通透性会显著增加。黄芪及川芎注射液配伍应用可以显著降低血脑屏障通透性,降低溶栓对紧密连接相关蛋白Claudin-1、Claudin-5的破坏作用,这可能是对溶栓后大鼠血脑屏障结构与功能保护作用的机制之一。同时各研究结果均发现川芎嗪注射液与黄芪注射液配伍应用,对保护血脑屏障和TJ结构的作用效果较单用一种更显著,也更持久。血脑屏障的TJ不仅仅是被动结构,而且更是动态的功能性实体,它能被许多信号机制调节以满足血脑屏障变化和反应的需要。在今后的研究中,我们将通过信号传导机制等方面进一步深入探讨芎芪有效成分对紧密连接的作用。中医药现代化研究正在蓬勃发展,但是在预防溶栓后出血转化,特别是深入研究其机制方面并未见太多报道。我们的研究结果与现代研究现状均相符合,并为今后利用中药复方的多组分特点及采用中西医结合疗法来提高溶栓成功率、预防出血转化、扩大溶栓适用范围的研究打下了一定的基础。