维生素C生产菌株生理功能解析与发酵优化

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本论文以2-酮基-L-古龙酸(2-KLG,维生素C前体)工业生产菌株普通生酮基古龙酸杆菌(Ketogulonicigenium vulgare) WSH001与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)WSH002为研究对象,通过对其代谢网络模型iWZ663与iMZ1055进行模拟分析,预测K. vulgare与B. megaterium代谢能力,利用湿实验对模拟结果进行验证,进而建立了K.vulgare生长营养谱与最小合成培养基(Minimal chemically defined medium, MCDM),提出了外源添加乙醛酸的优化策略,并从新角度解析了两菌生理关系。主要研究结果如下:1.模拟分析发现K. vulgare WSH001不能合成多种生物量组分:L-天冬酰胺、L-甘氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、硫胺素、泛酸盐、吡哆醇与叶酸。利用湿实验验证模拟结果,发现从全合成培养基中减去L-甘氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、腺嘌呤、胸腺嘧啶、硫胺素与泛酸盐后,K. vulgare的生长量分别减少为对照的1%、21%、16%、1%、26%、57%、73%与24%;补加相应物质后,K. vulgare生长量恢复到全合成培养基的41.9%、107.1%、82.3%、99.4%、81.3%、94.5%、102.9%与112.9%。基于以上实验结果,建立了MCDM。在MCDM中,K. vulgare生长量与2-KLG产量分别为0.28OD600与3.59g·L-1;混菌生长量与2-KLG产量分别为2.15OD600与51.5g·L-1。2.根据K. vulgare WSH001生长营养谱,对K. vulgare与混菌的发酵营养条件进行了优化。将乙醛酸添加至L-甘氨酸单缺培养基后,K. vulgare生长量与2-KLG产量分别恢复至全合成培养基的126.1%与111.2%,验证了乙醛酸对L-甘氨酸的回补作用。向玉米浆发酵培养基中添加0.5g·L-1乙醛酸后,K. vulgare的生长量、2-KLG产量与生产强度分别比对照提高了46.8%、25.0%与24.7%;混菌生长量、2-KLG产量与生产强度分别比对照提高了33.3%、5.1%与5.7%。3.代谢模型iMZ1055指出B. megaterium WSH002能代谢葡萄糖,但不能代谢山梨糖。湿实验发现胞外碳源会延缓芽孢形成,而随着山梨糖浓度的增大,B. megaterium芽孢形成率下降。利用基因比对、荧光染色与流式细胞分析等手段,发现B. megaterium在山梨糖存在的情况下发生了同类相食(自食),且自食程度随山梨糖浓度的降低而增大。混菌中B. megaterium的芽孢形成率与自食细胞百分比皆高于B. megaterium单独培养,其原因是混菌中的K. vulgare消耗山梨糖,使得山梨糖浓度降低至更易形成芽孢与自食的范围。芽孢形成与自食皆导致细胞裂解,由此从新的角度解析了两菌生理关系:混菌中的K. vulgare消耗山梨糖,加快了B. megaterium的裂解;B. megaterium裂解,释放大量营养物质,促进K. vulgare生长;K. vulgare生物量的增大会进一步加速山梨糖的消耗。整个过程是一个有利于K. vulgare生长与产酸的“良性循环”。
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