需钠弧菌（Vibrio natriegens）是一种革兰氏阴性非致病海洋细菌,具备快速的生长、高效的底物摄取及强大的蛋白表达能力,除可作为代谢工程改造的底盘细胞外,还可作为表达宿主进行外源蛋白的高效表达,在生物技术领域具有良好的应用前景。乙偶姻是一种重要的C4平台化合物,广泛应用于食品、化工、化妆品等行业。1,3-丁二醇作为非天然的C4二醇,被广泛应用于多种工业领域。本论文旨在建立V.natriegens的高效基因敲除方法;通过对V.natriegens进行代谢工程改造,利用V.natriegens的耐盐特性使用海水代替淡水非灭菌发酵生产乙偶姻;基于V.natriegens蛋白表达宿主Vmax-1,异源表达和纯化1,3-丁二醇人工合成途径中的7个酶,验证以葡萄糖为底物,通过体外合成生物体系生产1,3-丁二醇的可行性。论文第二章在课题组内建立了 V.natriegens模式菌株ATCC 14048的基因敲除技术。首先使用基于双亲杂交和自杀质粒的同源重组以及基于自然转化和FLP/FRT的位点特异性重组技术（又被称为自然转化多重基因编辑技术,MuGENT）对V.natriegens中dns基因进行了敲除。发现使用同源臂长度为1500 bp的线性DNA片段,MuGENT技术的第一轮筛选阳性率为85%,后续抗性标记消除效率为100%,相比基于双亲杂交和自杀质粒的同源重组技术具有显著优势,但会在基因组上留下FRT位点。为解决该问题,建立了基于自然转化和归巢内切酶I-SceI的V.natriegens中基因无痕敲除技术。使用同源臂长度为1500 bp的线性DNA片段,第一轮筛选的阳性率为91%,第二轮筛选的阳性率为30%,但阳性转化子均为实现无痕基因敲除的菌株。该方法可实现V.natriegens的快速基因编辑,且不会在V.natriegens基因组上留下标记,为V.natriegens的代谢工程改造提供了良好的技术支持。基于海水的非灭菌发酵可以简化发酵工艺流程,节约能源消耗与淡水资源。论文第三章基于V.natriegens的耐盐特性,探索了使用海水代替淡水非灭菌发酵生产乙偶姻的可行性。首先在V.natriegens ATCC 14048中表达来自阴沟肠杆菌SDM的乙偶姻合成基因获得工程菌株VN-1,确定菌株VN-1可在海水配制的VN基本培养基中通过非灭菌发酵生产乙偶姻,乙偶姻的产量及得率与用蒸馏水配制的VN基本培养基经灭菌后发酵基本一致;敲除菌株VN-1中琥珀酸及乳酸合成基因获得工程菌株VN-4,通过外源添加乙酸钠促进乙偶姻合成基因表达,菌株VN-4可在15 h内,经补料分批发酵消耗74 g/L葡萄糖,积累乙偶姻29.10 g/L,乙偶姻得率为0.39 g/g,生产效率达1.94 g/L/h。V.natriegens具有作为蛋白表达宿主的潜力,论文第四章设计了一条基于葡萄糖,且辅因子内部循环再生的1,3-丁二醇人工合成途径,分析了 V.natriegens作为宿主表达纯化1,3-丁二醇合成相关蛋白的可行性。将7个1,3-丁二醇合成相关蛋白的表达质粒引入商业化V.natriegens表达菌株Vmax-1中,确定了各蛋白表达纯化的最适条件。对基于V.natriegens Vmax-1和常规蛋白表达宿主大肠杆菌（Escherichia coli）BL21表达纯化的葡萄糖脱氢酶GDH、二羟基羧酸脱水酶PuDHT、醛醇氧化酶ALDO活力进行测定,发现以Vmax-1为宿主获得的重组蛋白活力略高于以E.coli BL21为宿主获得的重组蛋白。最后使用7个通过Vmax-1表达纯化的蛋白耦合商品化过氧化氢酶,初步实现了基于葡萄糖的1,3-丁二醇体外生物合成。