家蚕是支撑蚕丝产业的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫中的典型模式生物。对家蚕基因组及其重要功能基因的研究,将对蚕丝业和农林害虫的防治和生物制药产业产生深远的影响。当前,转基因技术已成为研究重要功能基因、开发生物反应器、创造新素材新品种、进行生物防治的理想途径和有效方法。然而,与其它模式生物相比,家蚕的转基因技术体系尚处于构建和成熟的阶段,特别在我国。基本上处于摸索阶段。本研究以高效稳定的家蚕转基因技术体系的构建及其应用探索为重点,主要进行了以下5个方面的研究:　　 1建立了高效稳定的家蚕转基因技术体系获得转基因动物,基因导入是关键。在本研究中,我们利用两个具有不同启动子的piggyBac来源的载体pPIGA3GFP和pBac[3×P3-EGFPaf],对蚕卵进行了显微注射,并对蚕卵注射时间、注射DNA量等条件进行了探索,发现在蚕卵产下2小时左右注射,以水溶解DNA,注射量大约为10nl时获得转基因蚕的效率比较高。在注射A3GFP载体的61个G1蛾区中,9个蛾区检测到有荧光蚕的表达,G1代蛾区阳性率达到14.7％。遗传分析表明GFP荧光可以遗传,并且遵循孟德尔遗传规律,至今经过10多代饲养,转基因系GFP仍然稳定表达。对转基因系进行Southernbloting分析表明,GFP基因以1-3个拷贝插入家蚕染色体上,通过iPCR对转基因插入位点两侧的序列分析,所有插入位点两侧都有TTAA特征性序列,表明转基因是由转座作用所引起。　　 2家蚕GALA/UAS系统的建立利用酵母GAL4/UAS系统可精确控制目的基因的表达时间和场所等的特性,结合以piggyBac为载体的转基因蚕技术和家蚕RNAi技术,能够实现特定基因功能的丧失或特定基因功能的获得,从而使家蚕重要功能基因功能的研究和利用成为可能。本研究基于此目的,构建了GAL4和UAS转基因载体,注射蚕卵后,获得了GAL4转基因系和UAS转基因系。在UAS转基因系中,以家蚕Magonashi基因为靶基因,将GAL4转基因系和UAS转基因系杂交后,发现后代中Magonashi基因表达显著提高,表明我们成功利用GAL4/UAS系统实现了在家蚕中靶基因的过量表达,为今后家蚕功能基因组的研究奠定了基础。　　 3在家蚕后部丝腺特异表达植酸酶融合蛋白在成功建立了转基因家蚕技术体系的基础上,本研究利用来源于一株黑曲霉的植酸酶基因,构建了植酸酶融合表达载体pBac[3×P3-EGFP+FibL-phyA-DsRed]。该融合蛋白包含轻链丝素部分cDNA、植酸酶基因以及DsRed基因。在轻链丝素启动子序列的作用下,可调控这种融合蛋白在丝腺内特异表达,形成含有植酸酶蛋白和红色荧光蛋白的蚕丝。　　 我们将该载体注射了大约700粒蚕卵,在53个G1蛾区中,得纠3个转基因阳性蛾区,其中的转基因阳性个体在5龄蚕丝腺及茧壳都可检测到红色荧光表达。Sounthernblot和反向PCR结果也证明转基因表达盒整合到家蚕染色体上。将转基因蚕的茧壳用饱和LiSCN溶解后,经Westernblot分析,检测到约107kDa的条带,与预期的融合蛋白大小相符,表明我们成功得到表达植酸酶基因的转基因家蚕。家蚕丝腺具有巨大的蛋白质合成能力,是一种具有很大开发潜力的生物反应器,本实验在这方面进行了初步探索,为进一步开发家蚕生物反应器,无疑具有积极的促进作用。　　 4在中部丝腺特异表达人胰岛素样生长因子1基因(hIGF-1)本研究将hIGF-1基因的全长CDS序列及成熟肽编码序列与家蚕丝胶基因1上游调控序列构建成两个转基因表达载体,注射蚕卵后,分别获得40个和68个G1蛾区。经过对胚胎中后期的荧光检测,分别获得2个和4个转基因阳性蛾区。经RT-PCR分析,hIGF-1基因特异性地在转基因蚕中部丝腺表达；Elisa检测结果表明,在1ml丝胶蛋白质(1.6mg)中可检测到约510-890ng的IGF-1蛋白；Westernblot结果显示丝腺表达的hIGF-1为7.5kd的成熟hIGF-1。对丝腺表达的IGF-1进行生物学活性检测,发现添加rhIGF-1可促进NIH3T3细胞的生长,具有良好的生物学活性。　　 5利用转基因RNAi技术提高家蚕对BmNPV的抗性的探索本研究选择了BmNPV的DNA聚合酶、ProteinKinase(PK1)、bro-d、orf1629基因的部分编码片段,以反向重复的形式与BmActin3启动子构建了转基因表达载体,通过显微注射蚕卵,获得了36-107个G1蛾区,得到了20-123头转基因阳性蚕。经过RT-PCR及Southern杂交分析表明,4个BmNPV的片段都已经导入家蚕基因组中,并进行了转录。从攻毒实验看出,只有BmNPV的DNA聚合酶和ProteinKinase(PK1)的反向重复片段有干涉作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定的抗性；而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段几乎没有干涉作用。可能是由于BmNPV的DNA聚合酶和PK1基因是病毒DNA复制及表达所必需的基因,它们都属于早期表达的基因,在转基因系中被抑制后。就抑制了BmNPV的增殖。而bro-d基因虽然是BmNPV的必需基因,但不是最早期表达基因,当病毒DNA大量复制后,相对于病毒基因的大量表达,RNAi的效果就可能被掩盖；另外可能是转入家蚕的BmNPV基因片段没有干涉抑制效果。