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T-2毒素在我国粮食作物和饲料中广泛存在,具有毒性强、脱毒困难等特点。动物在长期摄入低剂量T-2毒素污染的谷物或饲料后就会引起中毒,生长发育迟缓,体重明显下降,给畜牧业生产带来巨大的经济损失。炎性因子的大量表达和生长激素(Growth hormone,GH)的缺乏是导致生长抑制的重要原因。基因组学的结果表明,10、40 nM的T-2毒素显著下调GH表达的同时也显著下调转录因子AKNA(AT-hook transcription factor)基因表达(分别下调25.85和52.15倍),且显著上调白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-11(Interleukin-11,IL-11)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)基因的表达,但是目前关于T-2毒素诱导GH下调的分子机制尚不清楚。转录因子AKNA与炎性因子的表达密切相关,当AKNA基因被敲除时,可导致新生小鼠的死亡和中性粒细胞介导的炎症反应,引起IL-1β和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)基因表达量增加,但是AKNA如何调控炎性细胞因子表达的目前并不清楚。因此推测,转录因子AKNA可能是T-2毒素诱导的GH下调的一个关键调控因子,T-2毒素通过抑制AKNA表达导致炎性反应以及GH合成和分泌降低。我们以转录因子AKNA为切入点,深入阐释调控转录因子AKNA表达的分子机制以及AKNA在T-2毒素介导的炎性反应和GH下调中的作用,确定毒素作用的关键靶点和信号通路,为保障动物健康,开发出高效、安全的新型拮抗剂提供科学依据,并为全面评价T-2毒素的风险奠定基础。分别用浓度为10 nM和40 nM的T-2毒素处理GH3细胞0.5、1、2、4、8和12 h,用浓度为5 nM、10 nM、20 nM、40 nM和80 nM的T-2毒素处理GH3细胞12 h,通过qRT-PCR检测AKNA的mRNA表达水平与T-2毒素间的时效关系与量效关系,结果表明T-2毒素可呈时间依赖型和剂量依赖型的下调转录因子AKNA的表达。用不同的信号通路抑制剂预处理细胞后,再加入T-2毒素,以筛选T-2毒素作用下参与调控转录因子AKNA的信号通路,结果表明PKA/CREB、NF-κB和MAPK/p38信号通路抑制剂能显著逆转T-2毒素所致的AKNA表达的下调。通过生物信息学分析发现AKNA启动子区含有PKA/CREB和NF-κB信号通路中关键蛋白CREB和p65基因上的结合位点。将构建成功的CREB和p65过表达载体转染到GH3细胞,结果显示过表达CREB和p65后转录因子AKNA表达水平显著下调,表明CREB和p65可负调控AKNA的表达,PKA/CREB和NF-κB信号通路可能是调控AKNA表达的关键信号通路。用40 nM的T-2毒素分别孵育GH3细胞0.5、1、2、4、8和12 h,采用间接免疫荧光双标技术结合激光共聚焦显微镜观测CREB和p65的磷酸化入核过程和AKNA在细胞中的位置。未加毒素处理时,磷酸化CREB主要位于细胞核,磷酸化p65和AKNA主要位于细胞质;T-2毒素孵育后细胞核中的磷酸化CREB和磷酸化p65明显增加,T-2毒素处理1 h后细胞核中的磷酸化CREB增加最明显,T-2毒素处理8 h后细胞核中的磷酸化p65增加最明显;转录因子AKNA在T-2毒素处理2 h后开始进入细胞核,8 h后入核最明显。由此可知,T-2毒素促使CREB和p65蛋白磷酸化并进入细胞核,从而激活PKA/CREB和NF-κB/p65信号通路,调控下游基因的表达;在大鼠细胞中转录因子AKNA主要位于细胞质,T-2毒素可促使AKNA进入细胞核发挥毒理效应。为了确定CREB和p65调控AKNA的作用方式,通过双荧光素酶报告基因检测发现CREB和p65可极显著下调AKNA启动子区域的转录活性。通过染色质免疫共沉淀结合荧光定量PCR分析发现,CREB蛋白和p65蛋白可分别与AKNA基因近端启动子(-1862 bp和-1476 bp)结合,T-2毒素可显著增加CREB和p65与AKNA启动子区域的结合活性。由此可知,磷酸化CREB和磷酸化p65蛋白可直接与AKNA启动子结合从而抑制AKNA的转录表达,T-2毒素通过促进磷酸化CREB和磷酸化p65蛋白与AKNA启动子结合从而使AKNA表达下调。通过构建pSicoR-AKNA干扰载体并转染到GH3细胞抑制AKNA的表达,确定转录因子AKNA下游调控因子及其在生长抑制中的作用。抑制转录因子AKNA表达后加毒素处理,与仅加毒素处理组相比炎性因子IL-1β、IL-6、IL-11、TNF-α和MMP-9基因表达量降低,说明AKNA可正调控炎性细胞因子和MMP-9的表达,在T-2毒素介导的炎性因子和MMP-9上调表达中,除了AKNA调控炎性因子表达之外,还有其他的信号通路参与T-2毒素诱导的炎性因子的上调表达。抑制转录因子AKNA表达后还发现GH的表达显著下调,说明AKNA是介导GH下调的一个重要调控因子,在T-2毒素诱导GH下调的生长抑制中具有重要作用。转录因子AKNA很可能是T-2毒素诱导生长抑制的一个重要的新的靶标。综上所述:本课题以转录因子AKNA为靶标研究T-2毒素介导的生长抑制毒性作用机理,系统的阐释了调控AKNA表达的分子机制以及AKNA在T-2毒素诱导的GH下调和炎性细胞因子大量表达中的作用。T-2毒素可以诱导PKA/CREB和NF-κB/p65信号通路中关键蛋白CREB和p65表达增加,增加CREB和p65蛋白磷酸化水平,促使磷酸化p65进入细胞核以及核内的磷酸化CREB增加从而激活PKA/CREB和NF-κB/p65信号通路,核内磷酸化的CREB和p65通过直接与AKNA启动子结合抑制AKNA的转录活性,从而使AKNA的基因表达显著下调。在大鼠细胞中转录因子AKNA主要位于细胞质,T-2毒素作用后进入细胞核发挥毒理效应。抑制转录因子AKNA表达后GH和炎性因子的表达显著下调,表明AKNA参与调控GH和炎性因子的表达,为T-2毒素介导的GH缺乏症提供一个新的下游分子靶标,且揭示了AKNA的分子调控机制,为以后AKNA分子调控方面的研究提供了重要参考,为T-2毒素的毒理机制和毒素防控提供了重要依据。