近年来,由于西部高原经济建设及军事斗争的需要,将会有越来越多的人进入高原。高原缺氧引起的健康损害及其预防措施的研究正越来越受到人们的关注。研究发现,缺氧引起的氧自由基增加,是缺氧导致机体组织细胞结构与功能损伤的重要原因之一。因此,服用能够有效清除自由基、具有抗氧化作用的药物,对于预防高原缺氧损伤可产生积极的作用。马齿苋作为一味常用的药食两用中药。本课题组前期研究发现,马齿苋提取物具有延长缺氧小鼠生存时间的作用,其主要机制可能是通过提高缺氧组织HIF-1α含量,进而促进EPO的表达。另外,大量文献表明,马齿苋具有显著的抗氧化活性。综上所述,我们认为马齿苋提取物除了通过提高缺氧组织中HIF-1α的含量,调节下游低氧适应基因来发挥其抗缺氧作用以外,马齿苋的抗氧化功能可能也是其抗缺氧作用的重要组成部分。另外,原提取的马齿苋抗缺氧有效部位化学成分复杂,不利于进一步深入研究马齿苋抗缺氧的作用机制,且不利于制定马齿苋作为抗缺氧药物进行生产的质量控制标准。基于上述问题,我们进行了如下研究：目的1.在原有的提取组分基础上进一步对马齿苋进行精制提取,通过小鼠密闭缺氧实验筛选出有效的抗缺氧组分,并对其主要化学成分进行分析鉴定。2.通过体外和体内实验,了解马齿苋提取物的抗氧化作用机制,及其对缺氧小鼠氧化损伤的保护作用。方法1.马齿苋抗缺氧有效部位的进一步分离提取1.1采用醇提水沉法和大孔树脂层析法分离马齿苋提取物的各个组分。1.2在确定马齿苋醇提水沉沉淀组分为抗缺氧有效部位的基础上,采用正向硅胶柱色谱层析法,用石油醚：乙酸乙酯的不同配比做洗脱剂,将马齿苋沉淀部分分离成5个不同极性组分,采用薄层色谱法(TLC法)及气相-质谱(GC-MS)法,分析各组分的主要化学成分。1.3利用小鼠常压密闭缺氧实验观察马齿苋提取物的抗缺氧作用。2.马齿苋提取物的体外抗氧化能力测定2.1用紫外分光光度计检测DPPH自由基与样品结合后在517 nm波长的吸光度,分析不同浓度马齿苋提取物清除DPPH自由基的能力；2.2用邻二氮菲(Fenton)体系,通过紫外分光光度计检测各样品液在550nm波长下的吸光度,分析不同浓度马齿苋提取物清除羟基自由基能力；2.3通过碱性条件下二甲基亚砜氧化产生氧自由基,利用紫外分光光度计测定550nm波长下各样品的吸光度,分析不同浓度马齿苋提取物抑制超氧阴离子的能力；2.4将亚油酸和磷酸盐缓冲液置于40℃电热恒温培养箱中放置132h,使亚油酸发生脂质过氧化,利用紫外分光光度计于500nm波长下测定各样品的吸光度,分析不同浓度马齿苋提取物抑制亚油酸脂质过氧化的能力；2.5在含不同浓度马齿苋提取物的醇溶液中,分别加入K3Fe(CN)6,利用紫外分光光度计于700nm波长下测定各样品的吸光度,分析马齿苋提取物的还原能力。3.马齿苋提取物对缺氧小鼠氧化应激损伤的缓解作用研究3.1实验动物分组及缺氧处理5-6周雄性ICR小鼠50只,体重(20±5)g,随机分为常氧+生理盐水处理组(空白对照组)、低氧+生理盐水处理组、低氧+马齿苋低剂量组(1g生药／ml)、低氧+马齿苋中剂量组(2g生药／ml)、低氧+马齿苋高剂量组(4g生药／ml)。各组小鼠分别灌胃7天,于最后一次灌胃1h后放入常压低氧舱暴露12h(O28%,N292%),取出立即在冰上断头处死,取小鼠肝脏、心脏、脑组织,于-80℃下保存。3.2采用试剂盒测定各组小鼠脑、心、肝组织中MDA的含量以及SOD和GSH-Px的活性4.数据统计与处理实验数据采用SPSS13.0统计软件,采用单因素方差分析进行数据分析,实验数据以平均数±标准差(X±S)表示,显著性水平为P<0.05,非常显著性水平为P<0.01。结果1.马齿苋抗缺氧有效部位的进一步分离提取1.1采用醇提水沉法和大孔树脂层析法将马齿苋分成了7个不同的组分：总提液组、上清液组、水洗脱液组、50%乙醇洗脱液组、95%乙醇洗脱液组、50%+95%乙醇洗脱液组、沉淀组,其中马齿苋沉淀组能明显延长常压密闭缺氧小鼠的生存时间(P<0.01)。1.2采用正相硅胶色谱柱层析法按照不同极性将马齿苋沉淀分离成15：1、10：1、5：1、2：1、1：15个组分,其中2：1、1：1组分为低极性组分,两组均能明显延长常压密闭缺氧小鼠的生存时间(P<0.01)。1.3马齿苋低极性组分的主要化学成分为大量的萜类和不饱和脂肪酸类,及少量的甾体类。2.马齿苋提取物的体外抗氧化能力测定2.1马齿苋提取物浓度达到10mg/ml时,对DPPH自由基的清除率达到85.72%,马齿苋提取物对DPPH自由基的半数清除率达到3mg／ml；2.2马齿苋提取物浓度达到5mg/ml时,对羟自由基的清除率达到79.60%,马齿苋提取物对羟自由基的半数清除率达到0.92g／ml；2.3马齿苋提取物浓度达到5mg/ml时,对超氧阴离子的抑制率达到88.10%,马齿苋提取物对超氧阴离子自由基的半数清除率达到1.03mg/ml;2.4马齿苋提取物浓度达到10mg/ml时,对亚油酸脂质过氧化的抑制率达到87.69%；2.5浓度为200μg/ml时,马齿苋的还原能力比对照物丁羟甲苯低12.37%。3.第三部分马齿苋提取物对缺氧小鼠氧化应激损伤的缓解作用3.1与空白对照组(常氧+生理盐水处理组)相比,低氧+生理盐水处理组的小鼠脑,心,肝组织中MDA含量均显著增高(P<0.01),SOD和GSH-Px活性均显著降低(P<0.01)；3.2与低氧+生理盐水处理组对比,低氧+马齿苋低剂量处理组(生药浓度为1g／ml)的脑,心组织中MDA含量差异没有统计学意义,但是肝组织中MDA含量显著降低(P<0.05),低氧+马齿苋中、高剂量处理组(生药浓度为2和4g／ml)中,小鼠脑,心,肝组织中MDA含量都显著降低(P<0.01)；与空白对照组对比,低氧+马齿苋各处理组的小鼠各组织MDA含量仍较高(P<0.01)；3.3与低氧+生理盐水处理组对比,低氧+马齿苋低剂量处理组(生药浓度为1g／ml)的小鼠脑和心组织中SOD、GSH-Px活性差异没有统计学意义,但是肝组织中SOD、GSH-Px活性显著提高(P<0.05),低氧+马齿苋中、高剂量处理组(生药浓度为2和4g/ml)中,小鼠各组织中SOD、GSH-Px活性均显著升高(P<0.01)；与空白对照组对比,低氧+马齿苋各处理组的小鼠各组织SOD、GSH-Px活性仍较低(P<0.01)。结论1.马齿苋提取物的低极性组分具有良好的抗缺氧活性；采用TLC法和GC-MS法鉴定马齿苋低极性组分中含有大量的萜类和不饱和脂肪酸类,以及少量的甾体类；2.体外实验显示马齿苋低极性组分具有良好的清除DPPH、羟自由基、超氧阴离子能力及良好的抑制亚油酸脂质过氧化能力,但还原能力较弱。3.整体动物实验显示马齿苋提取物对缺氧小鼠的氧化应激损伤具有一定的保护作用。综上所述,表明马齿苋提取物可以提高缺氧小鼠体内SOD、GSH-Px活性,清除氧自由基,减少脂质过氧化产物MDA的生成,进而减轻了缺氧对组织细胞的损伤,即马齿苋提取物的抗氧化功效可能是其能够促进缺氧诱导因子表达之外提高实验动物缺氧耐受能力的又一个作用途径。