论文部分内容阅读
第一部分改良三袖套法建立大鼠左肺原位移植动物模型目的采用改良袖套法技术建立大鼠同种异体左肺移植模型。方法对供肺获取、套管制作、自体肺切除、血管和气管袖套套接技术进行改进。30例清洁级SD大鼠左供肺获取后置于40C的LPDG液保存3小时,随后行肉眼直视下同种异体左肺移植术,再灌注4h后阻断右肺门,分别测定阻断前后气道压力、动脉血气变化、肺W/D比率及光镜下肺组织结构变化。评价该模型复制移植物IRI的能力。结果同种异体左肺移植模型在肉眼直视下单人完成,供受体动静脉和支气管套管吻合时间分别为:肺动脉(4±1)min、肺静脉(8±3)min、支气管(2±0.5)min。总手术时间(55±10)min。手术成功率90%(27/30),术后生存率100%。实验结果显示该模型成功复制出同种异体肺移植IRI的变化。结论本模型符合大鼠肺移植模型建立的优点,全部操作在肉眼直视下单人完成;供肺的获取较为快速,使用的套管更简单,套管技术趋于简化,肺移植时血管套接技术成功率高,整体手术时间操作缩短。该模型复制出移植肺IRI的变化,是适合肺移植IRI研究的理想模型。第二部分内源性HO-1高表达对大鼠同种异体肺移植物缺血再灌注损伤的作用研究目的观察CoPP诱导内源性HO-1高表达对大鼠同种异体左肺移植物IRI的影响并探讨其作用机制。方法以SD大鼠为供受体,采用改良袖套法技术建立同种异体左肺移植模型。设立空白对照组(A组)、CoPP+ZnPP组(B组)和CoPP组(C组),离体供肺静脉40C的LPDG液逆行灌注,灌注后供肺保存3h后行左肺原位移植,移植肺再灌注4h后,阻断右肺门,测量气道压力,动脉血PaO2、PaCO2。随后处死大鼠,分别测定:肺W/D比率、肺组织中SOD活性、MDA含量、MPO活性;光镜观察移植物病理组织学变化;PCR和免疫组化了解HO-1表达;ELISA检测移植肺TNF-a量的变化;免疫组化检测TNF-a、IL-10、bcl-2表达情况;TUNEL法检测移植肺细胞凋亡水平。结果基因和蛋白水平检测显示C组肺组织HO-1较A组、B组明显升高(P<0.01),表明C组供肺成功高表达HO-1。与A、B组相比,C组气道压力降低、PaO2上升、肺W/D比率下降,SOD活性增高,MDA含量和MPO活性下降(P<0.01);病理检查C组肺泡间质水肿明显减轻,炎症细胞浸润减少,肺泡腔内水肿液和红细胞少见;免疫组化TNF-a表达减弱、IL-10表达增强,bcl-2表达增强(P<0.01);TUNEL法检测移植肺细胞凋亡减少(P<0.01)。结论CoPP有效诱导移植肺高表达内源性HO-1。HO-1通过其抗氧化、抗炎和抗凋亡等多种途径明显减轻供肺IRI,提高肺移植术后早期肺功能。因此应用CoPP诱导移植肺局部高表达内源性HO-1可成为预防和减轻同种异体肺移植IRI的一种策略。第三部分腺病毒介导HO-1离体转基因对大鼠同种异体肺移植物缺血再灌注损伤的影响目的观察腺病毒介导HO-1转基因对大鼠同种异体左肺移植物IRI的影响并探讨其作用机制。方法以SD大鼠为供受体,采用改良袖套法技术建立同种异体左肺移植模型。设立空白对照组(Ⅰ组)行离体供肺静脉40C LPDG液逆行灌注,空载体对照组(Ⅱ组)和基因转染组(Ⅲ组)分别行肺静脉逆行灌注40C LPDG液稀释的空病毒载体和重组腺病毒载体(6.1×1010v.p/ml)。供肺保存3h后行左肺原位移植,移植肺再灌注4h后,阻断右肺门,测量气道压力,动脉血PaO2、PaCO2。随后处死大鼠测定:肺W/D比率、肺组织中SOD活性、MDA含量、MPO活性;光镜观察移植物病理组织学变化;PCR和免疫组化法测定肺组织HO-1表达;ELISA检测移植肺TNF-a量的变化;免疫组化检测TNF-a、IL-10、bcl-2表达情况;TUNEL法检测移植肺细胞凋亡水平。结果基因和蛋白水平检测显示Ⅲ组肺组织HO-1表达较Ⅰ组、Ⅱ组明显升高(P<0.01),表明Ⅲ组供肺成功特异性转染外源性HO-1目的基因。与Ⅰ组、Ⅱ组相比,Ⅲ组气道压力降低、PaO2上升、肺W/D下降、SOD活性增高、MDA含量和MPO活性下降(P<0.01);光镜检查Ⅲ组肺泡间质水肿明显减轻,炎性细胞浸润、肺泡腔内水肿和渗出改变明显减轻;免疫组化移植肺TNF-a表达减弱,IL-10表达增强;bcl-2表达增强(P<0.01),TUNEL法检测移植肺细胞凋亡减少(P<0.01)。结论Ad5-HO-1的构建为开展HO-1基因治疗创造了有利条件。腺病毒介导HO-1转基因治疗能成功地在移植肺高表达外源性HO-1目的基因。HO-1通过其抗氧化、抗炎和抗凋亡等多种途径明显减轻供肺IRI,提高肺移植术后早期肺功能。因此应用腺病毒介导转基因技术在移植肺局部高表达HO-1可成为预防和减轻同种异体肺移植物IRI的一种新策略。