研究背景:　　 近期有研究发现在一些实体瘤如肺癌，前列腺癌，乳腺癌等肿瘤周围血管内皮有促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor，FSHR)的表达，这提示着FSHR可能参与了血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等因子介导的肿瘤血管生成的过程。促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)及其受体还在卵巢癌和前列腺癌的发病过程中发挥了重要的作用。研究发现FSH可以作用于FSHR参与多条信号通路的转导，还可以通过上调上皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR），VEGF等蛋白的表达量，进而参与细胞的增生、侵袭、迁移及肿瘤血管生成的过程。　　 FSHR属于G蛋白偶联受体家族，该基因是在鼠睾丸首次克隆发现。生理条件下，FSHR特异性表达于睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞中，少数表达于性腺的血管内皮细胞。迄今为止，研究者们已在许多物种上发现多种FSHR的变异体。在绵羊和鼠的性腺上发现pre-mRNA通过选择性剪切产生了至少4种FSHR亚型(FSHR1～4)，这些亚型的氨基端相同，而羧基端不同。这些由同一基因产生的不同受体因其不同的空间结构可以表现为主导正性，主导负性，生长因子型和可溶性结合蛋白的特征。有学者认为FSHR基因的多态性可能与卵巢对FSH的反应性有关，也有研究者发现一些FSHR剪切体可以显著降低cAMP的活化，且在不孕人群中占相当高的比例。　　 选择性剪切是真核细胞一种重要的mRNA转录后加工机制，由此而产生相应的多种mRNA异构体，使一个基因可以翻译为多种多肽序列，是基因表达多样性的重要表达形式。对人类基因组分析表明，目前60％的基因在表达过程中可通过选择性剪切，产生多种形式的mRNA，一种基因甚至可以产生上万种不同形式的mRNA。不同的选择性剪切与细胞生理、发育调节以及肿瘤的发生、转移有关。因此，研究基因的选择性剪切对了解基因功能有着重要意义。　　 本研究旨在对FSHR各种选择性剪切体的鉴定及其相关功能进一步的探讨，以期为深入了解和阐明该基因在女性生殖系统及一些恶性肿瘤中的表达调控研究提供重要的依据。　　 研究目的:　　 通过在人卵巢上皮组织上鉴定FSHR各种选择性剪切体，检测其在不同女性颗粒细胞及部分肿瘤细胞系的表达情况，构建包含各剪切体的质粒，研究其在调节细胞信号传导通路的相关功能。　　 研究方法:　　 1.收集卵巢囊肿病人正常卵巢上皮组织样本，提取总RNA，逆转录合成cDNA.　　 2.以卵巢上皮组织总RNA为模板，根据Genbank中FSHR序列设计特异性引物，经3'RACE PCR扩增目的基因。　　 3.实时定量PCR检测各剪切体在不同女性颗粒细胞及部分肿瘤细胞系的表达情况。　　 4.利用基因重组技术构建质粒。　　 5.瞬时转染人颗粒细胞癌细胞（KGN），Western Blot法检测各剪切体表达情况。　　 6.免疫荧光法和Western Blot法检测rhFSH处理不同剪切体转染KGN后P-Akt、Akt、P-ERK1/2、ERK1/2、P-p38 MAPK的表达变化。　　 研究结果:　　 1.经3'RACE，序列比对发现两种新的FSHR基因mRNA选择性剪切体。　　 提取人卵巢上皮组织总RNA，逆转录后，经3'RACE PCR扩增出3条目的片段。野生型FSHR(hFSHR-1，R1)全长约1700bps。与之相比，hFSHR-2(R2)缺失了第十个外显子并获得了一段额外的序列，而hFSHR-3(R3)仅由前六个外显子组成。　　 2.各个剪切体在不同女性颗粒细胞样本及部分肿瘤细胞系中表达情况。　　 收集30例接受(I)(V)F女性的颗粒细胞样本，实时定量PCR发现其中13个样本表达hFSHR-2，22个样本表达hFSHR-3，只有9个样本表达hFSHR-1。　　 22种细胞系中，19种细胞系表达hFSHR-2，1种细胞系表达hFSHR-3，3种细胞系表达hFSHR-1。　　 3.经酶切鉴定，测序成功构建质粒。　　 构建质粒pcDNA3.1-HA-FSHR-2和pcDNA3.1-HA-FSHR-3，瞬时转染KGN，Western Blot法检测HA-FSHR融合蛋白表达。　　 4.hFSHR-2和hFSHR-3可以抑制FSH介导的Akt、ERK1/2、p38 MAPK信号传导通路。　　 Western Blot结果显示:KGN表达hFSHR-1。10ng/ml rhFSH能以时间依赖性方式上调KGN的P-Akt、P-ERK1/2蛋白的表达水平。然而转染R2或R3后均抑制FSH介导的Akt、ERK1/2、p38 MAPK的磷酸化水平。免疫荧光法结果显示:转染R2或R3后，P-ERK1/2抗体标记的荧光强度均低于未转染组。　　 结论:　　 我们在人卵巢上皮上发现了2种新的FSHR mRNA选择性剪切体，它们可能作为主导负性作用受体参与FSH介导的细胞信号通路。