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一、研究背景心房颤动(Atrial fibrillation,AF)简称房颤,是临床上最常见的心律失常。研究表明,AF是血栓栓塞、缺血性中风发生的一个重要危险因素。AF发病机制复杂,目前尚未完全明了。既往关于AF的研究多侧重于心房结构重构、离子通道重构、心肌细胞内钙离子调控等方面,而作为信息介质的外泌体在AF机制中的作用的研究相对较少。近年来,外泌体在心血管疾病的病理机制调节中发挥细胞间旁分泌或远距分泌的作用得到越来越多的关注。外泌体是细胞分泌的直径约30-150nm的脂质双层膜性小泡,发挥细胞间信息传递的作用。原虫、真菌、植物和动物中的真核细胞均都能分泌外泌体。细胞膜内陷形成囊泡,经内质网和高尔基体加工后形成含有多个膜性小泡的多囊泡体,膜性小泡选择性地富集了蛋白质、RNA和DNA等多种生物活性分子。多囊泡体与细胞膜融合后,其内的膜性小泡释放至细胞外遂形成外泌体。外泌体内装载着特殊细胞来源的蛋白质、RNA或DNA,不同生理或病理状态下细胞分泌的外泌体内容物有所不同。有研究发现,某些外泌体内容物能发挥癌症疾病生物标志物的作用。作为外泌体的最重要的内容物之一,micro RNA(miRNA)是一种由内源基因编码的单链非编码小分子RNA,约含有22个核苷酸,主要功能是在转录后水平调控基因的表达,miRNA通过与mRNA的3’非翻译区的互补序列结合从而抑制翻译或诱导mRNA的降解。已有研究表明miRNA在AF的发生发展的病理机制中起重要作用,但关于外泌体中miRNA与AF关系的研究很少。如同在很多癌症疾病中一样,外泌体中的miRNA可能在AF的诊断及判断预后等方面发挥生物标志物的作用。二、研究目的1、观察非瓣膜病持续性AF患者与窦律(Sinus rhythm,SR)对照患者之间的血浆外泌体中miRNA的表达水平差异;2、明确差异表达的miRNA对于AF发生、发展的意义;3、分析哪些miRNA是AF的危险因素。三、研究方法选取2016年3月至2018年7月于海军军医大学第二附属医院胸心外科住院的非瓣膜病持续性AF患者(n=44)和因胸闷待查入院的SR患者(n=24),获取早晨空腹外周静脉血标本。1、血浆外泌体的提取及鉴定获取AF患者和SR患者的血标本,离心提取血浆,对血浆采用超速离心法去除细胞及细胞碎片后使用PBS洗涤以获取外泌体混悬液;通过以下方法鉴定所分离粒子是否符合外泌体特征:采用Nanosight LM10系统和电子显微镜对粒子进行粒径、浓度及形态学分析,采用Western blot对外泌体阳性标志物CD63、CD9和阴性标志物GAPDH进行检测。2、RNA高通量测序及qRT-PCR验证提取AF患者(n=4)和SR患者(n=4)血浆外泌体RNA,对RNA进行高通量测序并分析差异表达的miRNA。扩大样本量,提取AF患者(n=40)和SR患者(n=20)的血浆外泌体RNA,对部分测序结果中差异表达的miRNA进行qRT-PCR验证。3、生物信息学分析DESeq2.0算法用于分析miRNA的差异表达,错误发现率(FDR)<0.05,则认为miRNA表达差异具有统计学意义。利用miranda和RNAhybrid两种算法对差异表达的血浆外泌体miRNA的靶基因进行预测,通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库和Fisher确切检验法对靶基因进行基因本体学(Gene ontology,GO)分析和信号通路分析,P<0.05被认为有统计学差异。4、统计学分析本研究使用SPSS21.0软件及Graphpad软件对数据进行分析。计量资料表示为平均值±标准差,计数资料符合正态分布时组间差异使用t检验进行比较。计数资料以n(%)表示,并使用卡方检验或Fisher精确方法进行比较。采用单因素和多因素Logistic回归分析的方法分析AF发生的相关危险因素,P<0.05被认为有统计学差异。四、结果1、血浆外泌体的鉴定通过Nanosight LM10系统、电子显微镜检测发现,所分离的粒子粒径为30-150nm,符合外泌体粒径范围,AF患者的血浆外泌体浓度与SR患者相比未见明显差异。两组患者的血浆分离所得粒子Western blot结果提示外泌体标志物CD63和CD9均为阳性,而GAPDH为阴性。以上结果证明分离所得粒子为外泌体。2、miRNA测序结果通过高通量测序发现,AF组患者与SR对照患者血浆外泌体相比有39种差异表达的miRNA,包括21种上调的miRNA(miR-4786-3p,miR-4640-5p,miR-3663-3p,miR-6891-3p,miR-4690-5p,miR-6768-5p,miR-3916,miR-4654,miR-483-5p,miR-3929,miR-4800-5p,miR-7110-3p,miR-6124,miR-3611,miR-320b,miR-455-5p,miR-320a,miR-4758-5p,miR-4429,miR-34a-5p,miR-1181)和18种下调的miRNA(miR-184,miR-3174,miR-1185-1-3p,miR-548ah-3p,miR-6513-5p,miR-376c-3p,miR-548p,miR-3170,miR-4504,miR-6516-5p,miR-1296-5p,miR-223-3p,miR-30d-3p,miR-335-5p,miR-142-5p,miR-223-5p,miR-4326,miR-425-3p)。3、差异表达的miRNA的qRT-PCR验证对测序结果中差异表达的39种血浆外泌体miRNA中,选取6种在既往报道中参与心脏疾病的miRNA(miR-320a,miR-320b,miR-483-5p,miR-142-5p,miR-223-3p,miR-223-5p)进行qRT-PCR验证。结果显示:AF组与对照组相比血浆外泌体中miR-483-5p表达显著升高(2.11±1.13 vs.1.11±0.50,P<0.001),而AF患者血浆外泌体中miR-142-5p(0.84±0.34 vs.1.06±0.37,P=0.026),miR-223-3p(0.81±0.43vs.1.14±0.53,P=0.011),miR-223-5p(0.77±0.48 vs.1.11±0.69,P=0.028)表达水平均显著低于对照组。4、生物信息学分析生物信息学分析提示差异表达的血浆外泌体miRNA的靶基因主要参与心肌重构(PI3K-Akt信号通路,心肌细胞中的肾上腺素能信号通路,粘附斑激酶信号通路,Wnt信号通路,钙离子信号通路)和氧化应激(MAPK信号通路,催产素信号通路)相关的信号通路。5、AF危险因素的Logistic回归分析通过对性别、年龄、Body Mass Index(BMI)、冠心病、高血压、糖尿病、高脂血症、左心室射血分数、左心房内径、血浆外泌体miR-483-5p、miR-142-5p、miR-223-3p、miR-223-5p表达水平变化进行单因素Logistic回归分析,发现左心房内径增大、血浆外泌体miR-483-5p表达水平升高、血浆外泌体miR-142-5p表达水平降低、血浆外泌体miR-223-3p表达水平降低为AF发生的危险因素。多因素Logistic回归分析显示,左心房内径增大、血浆外泌体miR-483-5p表达水平升高是AF发生的独立危险因素。五、结论1、非瓣膜病持续性AF患者血浆外泌体中有39种miRNA表达水平变化,经qRT-PCR验证发现miR-483-5p表达水平显著升高,而miR-142-5p、miR-223-3p、miR-223-5p表达水平明显降低;2、差异表达的miRNA的靶基因与心肌重构及氧化应激相关的信号通路有关;3、左心房内径增大、血浆外泌体中miR-483-5p表达水平升高为非瓣膜病持续性AF发生的独立危险因素,提示miR-483-5p等差异表达的血浆外泌体miRNA水平在评估非瓣膜病持续性AF的严重性或预后等方面,可能具有生物标志物的潜力。