第一部分B7-H3分子在胰腺癌中的表达及其临床意义目的研究胰腺癌组织中共刺激分子B7同源性3（B7-H3）的表达与临床病理特征之间的关系。方法应用HE染色、酶联免疫吸附反应（ELISA）试剂盒及免疫组化(IHC)S-P法检测42例临床切除的胰腺癌标本中B7-H3的表达水平，分析其与肿瘤临床病理特征之间的关系。结果ELISA方法检测组织抽提液结果显示，胰腺癌和正常胰腺中B7-H3的表达水平依次为168.31±88.59ng/g、64.03±33.75ng/g，两组间差异有统计学意义(t=7.106，P＜0.001)。免疫组化检测结果显示B7-H3在胰腺癌组织中的表达明显高于正常胰腺组织（χ2=34.968，P=0.000），B7-H3的阳性表达与肿瘤的TNM分期、局部浸润、淋巴结转移有关。结论胰腺癌患者肿瘤组织中B7-H3呈过量表达，且肿瘤组织中B7-H3的阳性表达与肿瘤的TNM分期、局部浸润、淋巴结转移等恶性进展指标呈显著正相关。第二部分特异性B7-H3基因的RNA干扰有效靶点序列的设计与筛选目的构建靶向B7-H3的shRNA质粒载体，筛选出干扰效率最佳的RNAi靶点。方法根据B7-H3基因的DNA序列设计4个RNA干扰靶点，分别根据靶点序列合成4条小发卡RNA（shRNA），再分别构建4个shRNA质粒表达载体，并行PCR和测序鉴定。经鉴定正确后分别与过表达B7-H3的质粒共转染293T细胞，通过Western blot检测FLAG基因表达筛选RNA干扰有效靶点。结果构建的shRNA质粒表达载体经PCR及DNA测序鉴定表明质粒载体构建成功。特异性B7-H3基因的shRNA可抑制转染了过表达质粒的293T细胞的B7-H3基因的表达，其中以B7-H3-shRNA-4号序列的抑制作用最为显著。结论成功构建了特异性B7-H3基因的shRNA质粒表达载体并筛选出了最佳RNA干扰序列。第三部分稳定低表达B7-H3的胰腺癌细胞株的建立目的构建靶向B7-H3的shRNA慢病毒（Lentivirus，LV）载体，并转染人胰腺癌细胞系Patu8988，建立稳定低表达B7-H3的Patu8988细胞株。方法pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA4质粒，pHelper1.0质粒，pHelper2.0质粒共转染293T细胞，进行病毒包装，构建慢病毒载体LV-B7-H3-shRNA。测定滴度后转染Patu8988细胞，流式细胞仪（FCM）分选阳性细胞并检测转染效率，Real-time PCR、Western blot及流式细胞仪检测B7-H3基因的敲减效率。结果靶向B7-H3的shRNA慢病毒载体LV-B7-H3-shRNA构建成功，病毒滴度为3x109TU/ml。Sorting FCM分选后，转染效率已达90％以上且稳定表达，Real-time PCR和FCM检测B7-H3在mRNA水平和蛋白水平的抑制率分别是97.8%及83.4%。结论成功构建了LV-B7-H3-shRNA病毒载体，成功建立了稳定低表达B7-H3的B7-H3low/Patu8988细胞株。第四部分B7-H3在胰腺癌增殖及侵袭转移中的作用机制目的通过体外、体内实验研究B7-H3分子表达下降对胰腺癌Patu8988细胞增殖及侵袭转移能力的影响，探讨B7-H3分子在胰腺癌增殖及侵袭转移中的作用机制。方法实验分3组：空白对照组(Patu8988组)，阴性对照组(B7-H3+NC/Patu8988组)，实验组(B7-H3low/Patu8988组)。MTT法检测细胞增殖能力，细胞-基质粘附实验检测细胞粘附能力，划痕实验检测细胞水平迁移能力，Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。3组细胞分别建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型和原位模型。在皮下移植瘤模型实验中，观察抑瘤效果，HE染色证实为胰腺癌皮下移植瘤，免疫组化法检测B7-H3表达。在原位模型实验中，观察抑瘤效果并计算腹腔内原位移植瘤及转移瘤肿瘤重量。结果生长率测定结果显示，3组细胞在0、24、48、72h时间点MTT实验所得OD值差异均无统计学意义（F=0.191, P=0.831; F=0.327, P=0.733; F=982, P=0.428;F=412, P=0.680）。细胞-基质粘附实验结果显示，实验组对FN的粘附能力较空白对照组及阴性对照组明显下降。差异均有统计学意义（P均<0.05），而空白对照组和阴性对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。体外划痕实验结果显示，划痕后6、12、18、24h各时间点实验组相对宽度均大于空白对照组及阴性对照组，差异均有统计学意义（P均<0.05），而后两组间差异无统计学意义（P均>0.05）。Transwell实验结果显示，实验组侵袭过膜细胞数少于空白对照组及阴性对照组，差异均有统计学意义（P均<0.05），而后两组间差异无统计学意义（P>0.05）。裸鼠皮下移植瘤模型的实验结果显示，3组均建模成功，实验组皮下移植瘤的体积增长明显滞后于阴性对照组和空白对照组。实验结束时，实验组的肿瘤体积（61.67±8.91mm3）比空白对照组（227.67±56.35mm3）和阴性对照组（211.67±52.75mm3）明显减小，其差异有统计学意义(P均<0.0001)。皮下移植瘤免疫组化实验显示，实验组B7-H3表达阳性细胞数少于空白对照组及阴性对照组，差异均有统计学意义（P均<0.001），而后两组间差异无统计学意义（P=0.93）。裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型实验结果显示，实验组原位移植瘤+腹腔转移瘤的重量小于空白对照组及阴性对照组，差异均有统计学意义（P均<0.001），而后两组间差异无统计学意义（P=0.825）。结论在体外，B7-H3分子能够促进胰腺癌细胞粘附、水平迁移及侵袭转移，但不影响细胞生长曲线。在体内，B7-H3分子能够促进胰腺癌肿瘤生长，局部浸润和远处器官转移。第五部分B7-H3在胰腺癌抵抗吉西他滨化疗中的作用机制目的通过体外、体内实验研究胰腺癌细胞中B7-H3表达下降对其抵抗吉西他滨化疗的影响，探讨B7-H3分子在胰腺癌抵抗吉西他滨化疗中的作用机制。方法体外实验分3组：空白对照组(Patu8988组)，阴性对照组(B7-H3+NC/Patu8988组)，实验组(B7-H3low/Patu8988组)。MTT法检测在不同吉西他滨药物浓度下，胰腺癌Patu8988细胞B7-H3表达下降对其化疗敏感性的影响。PI实验检测在一定吉西他滨药物浓度下，胰腺癌Patu8988细胞B7-H3表达下降对细胞凋亡的影响。单色标记全基因组芯片筛选在一定吉西他滨药物浓度下，胰腺癌Patu8988细胞B7-H3表达下降对细胞凋亡相关基因表达的影响。Western blot检测B7-H3表达下降对细胞抗凋亡分子survivin表达的影响。在体内实验中，Patu8988组，B7-H3+NC/Patu8988组，B7-H3low/Patu8988组3组细胞分别建立人胰腺癌SCID小鼠皮下移植瘤模型，每组再根据是否接受吉西他滨化疗分为2个亚组。在动物模型实验中，观察抑瘤效果，HE染色证实为胰腺癌皮下移植瘤，TUNEL检测吉西他滨化疗各组胰腺癌皮下移植瘤的凋亡情况，免疫组化法检测吉西他滨化疗各组胰腺癌皮下移植瘤survivin表达水平。结果体外实验中，吉西他滨化疗敏感性实验结果显示，在0.50、1.00、2.50、5.00μmol/L等不同的吉西他滨药物浓度下，3组细胞的生长抑制率差异均有统计学意义（F=9.561, P=0.014; F=10.86, P=0.010; F=6.286, P=0.034; F=25.87, P=0.0011）。在4种不同的吉西他滨药物浓度下B7-H3low/Patu8988组生长抑制率与Patu8988组及B7-H3+NC/Patu8988组比较，差异均有统计学意义（P均<0.05），而后两组间差异无统计学意义（P均>0.05）。PI检测凋亡的实验结果显示，3组细胞经5.00μmol/L的吉西他滨处理48h后，B7-H3low/Patu8988组细胞凋亡率与Patu8988组及B7-H3+NC/Patu8988组差异均有统计学意义（P均<0.001），而后两组间差异无统计学意义（P=0.959）。抽提RNA经质检合格后，全基因组基因芯片检测结果显示，B7-H3low/Patu8988组survivin基因在mRNA水平的表达比B7-H3low/Patu8988组明显下降，差异有统计学意义（t=15.80，P<0.0001）。Western blot实验证实了基因芯片的结论。在SCID小鼠皮下移植瘤模型体内实验中，吉西他滨在低表达B7-H3的B7-H3low/Patu8988细胞成瘤组显示更强的抑瘤作用。相同吉西他滨治疗方案的B7-H3low/Patu8988+GCB组肿瘤体积（69.00±7.71mm3）比Patu8988+GCB组（290.00±36.88mm3）和B7-H3+NC/Patu8988+GCB组（285.80±40.89mm3）明显减小，其差异有统计学意义(F=77.515，P<0.0001)。而后两组差异无统计学意义（P=0.840）。TUNEL检测凋亡的实验结果显示， B7-H3low/Patu8988+GCB组皮下移植瘤的凋亡指数高于Patu8988+GCB组及B7-H3+NC/Patu8988+GCB组，差异均有统计学意义（P均<0.0001），而后两组间差异无统计学意义（P=0.97）。免疫组化实验显示，行吉西他滨化疗的各组SCID小鼠皮下移植瘤中survivin阳性细胞的比例， B7-H3low/Patu8988+GCB组低于Patu8988+GCB组及B7-H3+NC/Patu8988+GCB组，差异均有统计学意义（P均<0.0001），而后两组间差异无统计学意义（P=0.90）。结论胰腺癌表达的B7-H3分子可能通过调控抗凋亡分子survivin的上调表达，抑制肿瘤细胞的凋亡，而在拮抗吉西他滨的化疗中发挥着重要作用。