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研究目的1型糖尿病（T1DM）是由自身反应性T细胞介导的器官特异的慢性自身免疫性疾病。它是由T和B淋巴细胞共同引起的,最终导致胰岛β细胞功能障碍与免疫破坏引起的高血糖症。目前基本明确:T1DM发病机制中的自身免疫环节是由自身反应性T细胞应答所诱导的,是在遗传和环境因素共同作用下,胰岛细胞自身抗原经过加工呈递为MHC-II,并活化CD4+T细胞,进而激活CD8+T细胞、巨噬细胞、NK细胞并损伤胰岛β细胞,导致T1DM。自身反应性T细胞的异常活化是导致T1DM的主要免疫机制,阻断其异常活化是根本上阻止T1DM的重要手段。由锌转运体8（Zn T8）介导的胰岛β细胞损伤是其发病的重要环节。抗原肽/MHC复合物（pMHC）与T细胞抗原受体（TCR）之间特异性结合可以更有效的封闭TCR;并且T细胞的信号传导需要T细胞抗原受体二聚化,pMHC二聚体能够有效引起T细胞抗原受体二聚化,进一步封闭T细胞。已有的研究显示,可溶性Zn T8表位/MHC二聚体通过结合、封闭抗原特异性T细胞能够具有一定的诱导T1DM的免疫抑制功能。静电纺丝纤维膜的直径可达具有微米甚至纳米级,是作为细胞粘附、生长以及分化的最适合的载体。利用新型载体负载免疫抑制因子,通过诱导T1DM的免疫抑制,实现生物支架的免疫调节治疗1型糖尿病具有广阔的前景。本研究拟通过聚多巴胺（p DA）的梁嫁接技术使Zn T8表位/HLA-A2二聚体与明胶/聚乳酸静电纺丝支架结合,并保留二聚体结构的活性。通过二聚体的释放诱导T1DM的免疫抑制,最终实现生物支架的免疫调节治疗糖尿病小鼠,为阻断T1DM的发生发展提供新希望。研究方法为了表达HLA-A2/IgG1融合蛋白,我们将携带HLA-A2/IgG1融合基因的病毒载体转染293T细胞中。使用免疫荧光显微镜观察转染后细胞的荧光强度,并利用含嘌呤霉素的选择性培养基对转染阳性细胞进行筛选。应用RT-q PCR检测HLA-A2/IgG1融合基因的表达效果。将能够在含有嘌呤霉素的培养基中稳定生长的细胞单克隆培养,提取并检测细胞上清液中HLA-A2/IgG1融合蛋白的含量,继续培养并大量扩增其中生长状态良好同时目的蛋白表达水平较高的细胞。提取稳定过表达HLA-A2/IgG1基因的人293T细胞上清液,获得HLA-A2/IgG1融合蛋白,浓缩提纯后加入Zn T8（107-115）抗原肽,加载好抗原肽的Zn T8（107-115）/HLA-A2二聚体于4℃保存。依靠课题组前期研究所得的聚多巴胺改性的明胶/聚乳酸静电纺丝膜（PLLA/G-p DA膜）,将Zn T8（107-115）/HLA-A2二聚体加载到PLLA/G-p DA膜上。所得材料为负载pMHC的明胶/聚乳酸静电纺丝膜（PLLA/G-p DA-pMHC膜）。使用扫描电镜（SEM）、傅里叶红外光谱测定（FTIR）、接触角测定、力学性能测定、噻唑蓝染色等技术,对静电纺丝纤维膜进行理化性质评价。提取NOD小鼠脾淋巴细胞,将Zn T8多肽与小鼠脾淋巴细胞体外共培养,扩增表位肽特异性CTL,应用ELISpot检测小鼠脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ水平、CFSE染色方法检测表位肽刺激下CD8+T细胞增殖反应、ELISA试剂盒检测小鼠脾脏CD8+T细胞产生穿孔素（Perforin）水平,体外观察复合支架对表位肽特异性CTL的免疫作用。研究结果固相合成的多肽经中压液相色谱纯化,所得到的多肽先后用HPLC鉴定纯度和质谱测定分子量。结果表明,合成的3条多肽实际分子量与理论分子量基本相同,说明目标多肽合成准确。经中压液相色谱纯化后纯度大于97%,达到了后续实验中要求的多肽纯度要求。Zn T8（107-115）与HLA-A2.1分子亲和力分析结果表明Zn T8（107-115）能与HLA-A2.1分子结合且亲和力较高。将携带HLA-A2/IgG1融合基因的病毒载体转染293T细胞中。72h后在荧光显微镜下可以观察到大量绿色荧光,表明感染效率较高,且细胞的形态正常,表明重组慢病毒成功感染人293T细胞。应用RT-q PCR检测HLA-A2/IgG1融合基因的表达效果,结果显示,与空白对照组组相比,转染HLA-A2/IgG1过表达质粒组表达效率明显升高（P＜0.05）,提示HLA-A2/IgG1质粒有显著过表达效果,具有较高的转染效率。表明获得了过表达HLA-A2/IgG1基因的人293T细胞。将能够在含有嘌呤霉素培养基中稳定生长的细胞继续进行单克隆化,提取细胞培养上清液检测其HLA-A2/IgG1融合蛋白的表达水平,大量扩增生长状态良好且表达目的蛋白水平高的细胞。提取稳定过表达HLA-A2/IgG1基因的人293T细胞上清液,获得HLA-A2/IgG1融合蛋白,浓缩提纯后应用ELISA试剂盒检测HLAA2/IgG1二聚体蛋白的浓度为757.5 ng/m L,Western-blot结果显示HLA-A2/IgG1融合蛋白在未被还原处理前以HLA-A2/IgG1二聚体形式存在,分子量约为150k Da。向HLA-A2/IgG1二聚体溶液中加入过量Zn T8（107-115）抗原肽,即可合成Zn T8（107-115）/HLA-A2二聚体。将Zn T8（107-115）/HLA-A2二聚体加载到PLLA/G-p DA膜上。所得材料为负载pMHC的明胶/聚乳酸静电纺丝膜（PLLA/G-p DA-pMHC膜）。扫描电镜结果表明接枝Zn T8（107-115）/HLA-A2二聚体后支架的直径及孔径以及力学性能均无明显改变。pMHC能够被接枝于PLLA/G-p DA膜上且吸附率较高,提高了支架的亲水能力更强,更有利于纤维支架表面粘附细胞。MTT法检测细胞增殖实验表明PLLA/G-p DA-pMHC支架助于细胞的黏附和增殖,具有良好的细胞相容性。为下一步负载NOD小鼠BMSCs并移植入小鼠体内预防及治疗1型糖尿病提供固相载体。通过CFSE染色法检测PLLA/G-p DA-pMHC复合支架对Zn T8特异性CD8+T细胞的增殖能力,证明了PLLA/G-p DA-pMHC复合支架具有一定的抑制CTL增殖作用。使用ELISPOT方法检测PLLA/G-p DA-pMHC复合支架对Zn T8表位肽刺激特异性CTL分泌IFN-γ的影响,证明了PLLA/G-p DA-pMHC复合支架对Zn T8表位肽刺激特异性CTL分泌IFN-γ具有明显的抑制作用。同时应用ELISA检测表明PLLA/G-p DA-pMHC复合支架对Zn T8表位肽刺激特异性CTL分泌perforin的影响,证明了PLLA/G-p DA-pMHC复合支架对Zn T8表位肽刺激特异性CTL分泌perforin具有一定的抑制作用。结论1.HLA-A2/IgG1质粒转染293T细胞能够过表达HLA-A2/IgG1融合蛋白,浓缩提纯后加入Zn T8（107-115）抗原肽,能够合成Zn T8（107-115）/HLA-A2二聚体。2.PLLA/G-p DA-pMHC静电纺丝支架具有较适宜的纤维特征、亲水性以及生物相容性,增加了其表面细胞粘附水平。在体外抑制了糖尿病小鼠Zn T8特异性CD8+T细胞增殖和特定的CD8+T细胞的细胞毒性,具有一定的抑制反应性T细胞的能力。