背景与目的：舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤,约占口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的25%-40%。其恶性程度高、生长快、浸润性强,具有较高的区域性淋巴结转移率和复发率。近几十年来,尽管临床上以手术为主,术前术后的放疗或化疗为辅助的综合治疗已经很普遍,但对舌鳞癌生存率的提高并不明显。手术创伤大,术后常造成患者语言、进食等功能障碍及颜面部的畸形,放化疗产生较多的毒副作用,严重影响患者的生存质量。5年总体生存率仍然徘徊在55%-60%左右,复发和转移仍是影响预后的重要因素。因此,面对如何提高舌癌疗效这一世界难题迫切需要人类不断研究并寻找到更加安全有效的治疗途径。然而肿瘤的复发和转移是个复杂的多因素过程,是由肿瘤细胞的特征,肿瘤微环境的因素以及肿瘤细胞和周围微环境相互影响共同作用的结果。正常的细胞和其周围组织环境之间存在着动态平衡,两者相互作用可以调控细胞活性,决定细胞增殖分化、凋亡以及细胞表面相关分子的分泌和表达。而肿瘤的突变的过程是不断打破这一平衡的恶性循环过程。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞共同组成的一个复杂的集合系统。间质细胞和癌细胞之间可以相互诱导、相互作用,并产生大量的炎症因子、生长因子、趋化因子以及基质降解酶,有利于肿瘤的增殖、转移、侵袭和抗凋亡。早在1979年,Lord就提出了肿瘤微环境的概念,即指肿瘤在其发生过程中的内环境。在肿瘤微环境中,免疫炎性反应、组织缺氧和酸中毒、间质高压形成、生成大量的生长因子和蛋白水解酶等构成了微环境的生物学特征。这些特征对于肿瘤的增殖、侵袭、迁移、黏附及新生血管、淋巴管的形成具有重要影响,是肿瘤不断恶化并发生转移的重要原因。不难发现,在对肿瘤微环境研究的很多方面都渗透着肿瘤与炎症的联系,肿瘤与炎症的关系已经成为肿瘤研究的新方向,肿瘤炎症微环境的研究已经成为当今肿瘤研究的热点。有学者已将肿瘤的炎症微环境列为继生长信号的自给自足、对生长抑制信号的不敏感、对凋亡的逃逸、无限的复制能力、持续的血管生成能力、组织的侵犯和转移之后癌症的第七大特征。所以针对肿瘤相关炎症的治疗可以转变肿瘤炎症微环境,或者阻止炎症细胞移行到肿瘤灶。它们也可以将促肿瘤微环境调整为抑制肿瘤的微环境,增强特异的获得性免疫反应,抑制转移扩散。然而肿瘤炎症微环境靶点众多,从中挑选出重要的分子靶点是第一步,而弄清微环境中各种炎症因子水平的变化将会是确定靶点的关键。与肿瘤相关的炎症因子在不同类型的肿瘤中表达存在差异,对于特定的组织和特定种类的肿瘤其特异性炎症因子的确定是非常重要的。传统的免疫及组织学技术存在着所需样本量较大,不能同时检测大量抗原抗体指标及反映出致病过程中多种因子的复杂变化的制约因素。本研究想通过一种高通量、高效、精确的方法直接筛选出人舌鳞癌细胞株和正常口腔黏膜上皮细胞之间差异性变化的炎症因子,为进一步探讨差异性炎症因子对肿瘤生物学行为的影响及机制的研究提供前提,为寻找理想的肿瘤炎症微环境的治疗靶点奠定基础。随着人类基因组计划(HGP)顺利实施,以生命活动的执行者——蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越显得重要,并构想和发展了快捷、高效、并行、高通量的蛋白质组检测新技术——蛋白质芯片技术。蛋白质芯片能够同时分析上千种蛋白质的变化情况,使得在全基因组水平研究蛋白质的功能成为可能。抗炎症因子芯片是一种功能性的蛋白芯片,其将与炎症相关的细胞因子集成到一张芯片上,其能同时检测生物样品中与某些疾病或环境因素可能相关的炎症因子含量的变化情况。本研究通过应用蛋白质芯片技术(抗炎症因子芯片)筛选、分析不同侵袭能力的人舌鳞状细胞癌细胞株之间以及其和正常口腔黏膜上皮之间差异性炎症因子的表达及意义。同时结合文献用免疫组化方法检测差异性炎症因子在舌鳞癌组织中的表达情况,并进一步探讨其临床意义。研究内容共分两章：第一章应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研究；第二章MIP-3α在人舌鳞状细胞癌组织中的表达及其相关临床意义。第一章应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研究1.研究目的：差异性炎症因子的筛选为进一步探讨差异性炎症因子对肿瘤生物学行为的影响及机制的研究提供前提,为寻找理想的肿瘤炎症微环境的治疗靶点奠定基础。2.研究方法：体外培养人舌鳞癌细胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113和人正常口腔黏膜上皮细胞,消化后分别提取胞内、胞外蛋白,上芯片孵育,封闭,清洗。采用激光扫描仪Genpix4000B扫描芯片,用Axon GenePix Pro6.0软件提取芯片数据,对获得的80种细胞炎症因子表达数据采用AAH-CYT-G5的软件分析,上调因子信号值取大于200,比值大于2.0的因子为纳入标准；下调因子信号值取大于200,比值小于0.66的因子为纳入标准,对人舌鳞癌细胞株(UM-1、CAL-27、Tca-8113)组与人正常口腔黏膜上皮细胞组及高侵袭性细胞株(UM-1、CAL-27)组与低侵袭性组(Tca-8113)分别进行比较,筛选出差异性炎症因子。并结合文献挑选3种显著差异性炎症因子,用ELISA再次检测其蛋白的表达,所得结果用ONE-WAY-ANVON进行统计分析,进一步验证芯片结果。3.研究结果：根据纳入标准,从检测的80种因子中筛选出有差异性表达的炎症因子12种。其中在舌鳞癌细胞株和正常口腔鳞状上皮细胞之间,胞内IL-1β,IL-6, IL-8,TNF-a呈高表达,MCP-4呈低表达,胞外Osteoprotegerin呈高表达；在高侵袭株(UM-1、CAL-27)和低侵袭性细胞株(Tca-8113)之间,胞内RANTES, IL-6, IL-8, TNF-α呈高表达,IGFBP-4, TGF-β3呈低表达,胞外IP-10, MIP-1β, MIP-3α呈高表达。在ELISA验证结果中UM-1和CAL-27胞外IP-10, MIP-1α, MIP-3α的表达量均高于Tca-8113,在统计学上有显著性差异(P<0.05)。其验证结果与芯片结果一致。第二章：MIP-3α在人舌鳞癌组织中的表达及相关临床意义的研究1.研究目的：应用免疫组化方法检测差异性炎症因子MIP-3α在人舌鳞癌组织中的表达情况,并进一步探讨其临床意义。2.研究方法：收集广东省口腔医院2006年1月～2012年12月间手术切除并经病理证实的原发性舌鳞癌石蜡包埋组织标本46例,采用免疫组化SABC法检测舌鳞癌组织和正常舌部组织中MIP-3α的表达情况,并进一步探讨MIP-3α的表达与人舌鳞癌的临床分期、病理分级及淋巴结转移的相关性。3.研究结果：1.MIP-3α在人舌鳞癌组织中的阳性表达率高于正常舌组织,在正常舌组织和舌鳞癌组织中阳性表达率分别为30%(6/20)和78%(36/46),差异具有统计学意义(P<0.05)。2. MIP-3α阳性反应主要定位于细胞浆内,仍有部分位于细胞核,呈棕黄色颗粒状反应。舌鳞癌病例癌上皮组织中细胞浆或/和细胞核MIP-3α的表达染色明显,呈现黄色改变。正常舌粘膜上皮细胞浆或/和细胞核见棕黄色染色较浅且染色的细胞数较少。3.MIP-3α的表达与淋巴结转移、临床分期均相关(P<0.05),但与舌癌患者病理分级不相关(P>0.05)。全文结论：1.蛋白质芯片技术能够较为准确的筛选出不同舌鳞癌细胞株之间差异性炎症因子,而这些差异性炎症因子可能与肿瘤细胞的生物学行为有一定的联系。2. MIP-3α在舌鳞状细胞癌组织的表达较正常舌组织高,其表达量与舌鳞癌患者淋巴结转移、临床分期均有关,但与病理分级无关。