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蛋白质折叠在蛋白质合成过程中占有很重要的地位,蛋白质折叠过程极易受到外界环境胁迫影响。当大量错误折叠或未折叠蛋白聚集在内质网中,引起内质网胁迫(ER stress),启动未折叠蛋白应答(unfolded protein response UPR)帮助蛋白折叠,不能正确折叠的蛋白质进入ERAD(ER-associated degradation)降解途径后被降解。在模式植物拟南芥中,目前研究比较清楚的内质网未折叠蛋白应答调控通路主要有bZIP28-S1P/S2P和IRE1-bZIP60。但是其它基因在内质网UPR过程中的调节机制尚不清楚。本文采用遗传学、细胞生物学、生物化学与分子生物学等多种方法研究NAC103的生物学功能,重点研究NAC103在拟南芥内质网UPR调控通路中的作用及其调控方式。NAC103属于植物中特有的NAC家族,是典型的NAC家族蛋白,N端具有非常保守的DNA结合域,C端具有转录激活活性,在酵母和烟草细胞中能够形成同源二聚体。在拟南芥中过量表达35S::NAC103-YFP转基因植株OE-1中,使用内质网胁迫诱导剂衣霉素(TM)或蛋白酶体抑制剂MG132处理后,NAC103-YFP蛋白在细胞核内稳定表达。转基因植物OE-1在正常生长条件下表现为发育延迟、叶片呈现锯齿形、莲座叶数目增加、花器官异常。在加入内质网胁迫诱导剂TM的培养基上,与野生型拟南芥相比,过量表达NAC103转基因植物OE-1出真叶率较高,而低量表达NAC103的RNAi-2出真叶率较低,表明NAC103在内质网胁迫过程中发挥了重要作用。内质网胁迫后NAC103表达量大幅上调,而且它的诱导表达依赖于bZIP60,在bzip60单突变体和bzip28bzip60双突变体中几乎不被诱导上调表达。利用拟南芥原生质体瞬时转化法和双荧光素酶报告基因检测方法分析NAC103启动子序列中的顺式作用元件。通过不同截短片段和碱基突变分析,发现了NAC103启动子序列包含一个新的UPR顺式作用元件UPRE-Ⅲ (TCATCG)。非常有趣的是,结合原生质体瞬时转化、酵母单杂、凝胶迁移实验等多种方法证明bZIP60能够直接结合UPRE-Ⅲ,诱导NAC103上调表达。在依赖于bZIP60表达的53个下游基因中,10个基因的转录起始位点前500bp启动子序列中含有至少一个UPRE-Ⅲ顺式作用元件,19个基因的转录起始位点前1000bp启动子序列中含有一个以上的UPRE-Ⅲ顺式作用元件,表明UPRE-Ⅲ可能也是其它UPR基因上调表达的顺式作用元件。与野生型拟南芥相比,在NAC103过量表达转基因植物OE-1中,CRT1、 CNX1、PDI5、UBC32等UPR下游基因上调表达。利用原生质体瞬时转化方法和双荧光素酶报告基因检测方法分析发现CRT1、CNX1等下游基因的1000bp启动子序列能够响应内质网胁迫诱导。在拟南芥原生质体中,截短的NAC103D蛋白在正常条件下能够激活CRT1、CNX1、SHD、UBC32基因的启动子序列,暗示NAC103蛋白在植物体内能够诱导CRT1、CNX1等下游基因表达。总之,本文通过一系列遗传、细胞、生化等方法证明NAC103是NAC家族中具有转录激活活性的转录因子,过量表达后影响植物正常生长发育,NAC103在拟南芥抵御内质网胁迫过程中具有重要作用。当内质网胁迫后,通过bZIP60直接结合NAC103启动子中的顺式作用元件UPRE-Ⅲ诱导上调表达NAC103,编码的NAC103蛋白进入细胞核内调控UPR下游基因,在UPR调控通路中起到承上启下作用。