血吸虫病(schistosomiasis)是由人体血吸虫(schistosoma)感染引起的一种人兽共患寄生虫病，主要流行于亚洲、非洲、拉丁美洲的76个国家和地区。人体血吸虫主要有曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni,S.m)、埃及血吸虫(S.haematobium)和日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.j)等，我国仅有日本血吸虫病流行。据2008年全国疫情资料显示，我国尚有454个流行县(区)，约41万慢性感染者，且主要分布在螺情难于控制的江湖洲滩地区，部分地区的疫情还有所回升趋势，或伴随出现向城市蔓延的趋势，因此，血吸虫病仍然是我国重点防治的感染性疾病之一。　　 防治血吸虫病的主要措施是采取人畜同步化疗及易感地带灭螺等相结合的综合性防治方法，但由于现有的以吡喹酮为主要治疗药物的化疗再感染率高，且耐药性不断严重化，使得血吸虫病的防治进展缓慢，急需在防治理论与关键技术方面有所突破。上世纪80年代，随着分子生物技术的发展，血吸虫病疫苗研究重新获得了人们的重视，疫苗被认为是综合性防治措施的有效补充，即“药物化疗的短效作用与疫苗接种的长效免疫预防作用相结合不仅能有效减少疾病的总体发病率，也能避免单纯化疗后的重复感染”。　　 抗血吸虫病疫苗研究历经了死疫苗、减毒活疫苗、基因工程蛋白疫苗及核酸疫苗几个阶段。然而，近20年来的实验研究已证明，这种单纯以刺激Th1或Th2型体液免疫应答为主的特异性抗原分子并不能稳定地诱导动物模型高效的保护性免疫力，没有一个候选分子的保护性实验能获得高于40％的保护力。致弱尾蚴疫苗的研究始于上世纪60年代末，大量实验证明，经辐照致弱的侵袭性曼氏血吸虫或日本血吸虫尾蚴能诱导实验动物产生高达90％的保护性免疫力，以至于到现在仍是受公认的最高效、稳定的抗血吸虫病疫苗。对曼氏血吸虫致弱尾蚴疫苗的研究发现，这种保护性免疫力主要是由获得性免疫机制介导的，由Th1型优势细胞免疫应答向Th2型优势体液免疫应答发展的持续性免疫应答过程。　　 为此，我们实验室利用双向凝胶电泳和MALDI-TOF-MS质谱鉴定技术，比较分析紫外致弱尾蚴与正常尾蚴的可溶性虫体总蛋白，鉴定出20个差异表达蛋白。据蛋白功能分类可大致分为5类，分别为细胞骨架相关蛋白、能量代谢相关蛋白、信号转导/调控相关蛋白、热休克家族相关蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶体等，结果提示这些差异表达的蛋白质可能与致弱尾蚴诱导高水平免疫力有关，值得进一步研究。在这些差异表达的蛋白分子中，热休克蛋白家族(heat shock proteinfamily,HSP)由于其独特的生物学功能及免疫学特性，受到人们的广泛重视，特别是HSP70家族。在GenBank/EMBL中，至少存在3种血吸虫HSP70蛋白序列，其序列长度分别为637aa，648aa和653aa，均含有HSP特异性功能域序列。至目前为止，有关血吸虫HSP70的研究，主要是针对HSP70-648(一种开放读框为648aa的HSP70成员)，而有关其他两种血吸虫HSP70(HSP70-637和HSP70-653)的研究较少。序列分析发现，血吸虫HSP70在曼氏血吸虫和日本血吸虫之间高度保守，且与人类的mortalin分子的序列相似性高度70％以上。因此，我们将血吸虫HSP70-653暂时命名为日本血吸虫mortalin-like protein(SjMLP/hsp70)。　　 目的：本研究旨在通过对日本血吸虫SjMLP/hsp70的克隆、重组表达及其功能研究，为进一步揭示该分子在紫外致弱尾蚴诱导高水平保护性免疫力的效应中可能起的作用提供科学依据。　　 方法：主要是从原核和真核水平上，分别评价SjMLP/hsp70的生物学活性、抗原性及免疫保护性，并从真核水平上评价SjMLP/hsp70的佐剂效能。　　 结果：　　 ⑴日本血吸虫mortalin-like protein70(SjMLP/hsp70)的生物信息学分析。序列分析发现：SjMLP/hsp70具有DnaK功能域，属于热休克蛋白家族，其二级结构以α-螺旋为主；通过进化树分析提示，SjMLP/hsp70是进化上比较保守的蛋白，氨基酸序列上与曼氏血吸虫热休克蛋白70序列的相似性最高，与大肠杆菌DnaK的氨基酸序列在进化上也是比较接近的。SjMLP/hsp70含有13个潜在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点、8个潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点、6个潜在的N-肉豆蔻酰位点、3个潜在的糖基化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、1个潜在的亮氨酸拉链结构、1个潜在的酰基化位点；通过TargetP分析，发现SjMLP/hsp70定位在线粒体上；通过TMpred预测发现，SjMLP/hsp70具有信号肽，但没有明显的跨膜区；SjMLP/hsp70含有8个潜在的B细胞表位及多个T细胞表位。　　 ⑵根据GenBank中AY813185的序列信息(该序列为Sjmlp/hsp70的代表序列)，设计引物扩增Sjmlp/hsp70的ORF，进而将获得的目的基因定向插入到pET28a质粒中，经PCR、酶切及测序确证该目的基因克隆成功。根据文献报道，SjMLP/hsp70可分为核苷酸结合位点(nucleotide binding domain，NBD)及多肽结合位点(peptidebinding domain，PBD)两个功能域，为此，分别设计引物扩增SjMLP/hsp70的两个功能域，并克隆到pET28a中，经PCR、酶切及测序确证该目的基因克隆成功。RT-PCR结果证实目的蛋白的编码基因能在成虫、正常血吸虫尾蚴、机械力断尾后尾蚴及虫卵中均有转录。含pET28a-SjMLP/hsp70质粒的宿主菌经IPTG诱导2h后，能明显提高该含重组蛋白的BL21在45℃下的生存率(75％)，提示SjMLP/hsp70具有分子伴侣作用，而SjMLP/hsp70的两个功能域单独存在时，均不能改变宿主菌BL21的热休克后存活率(约40％)，提示这种分子伴侣作用是通过完整蛋白分子完成的。以重组蛋白免疫小鼠，检测免疫小鼠血清中特异性IgG水平，发现随着免疫次数的增加，特异性IgG滴度快速上升，以IgG2a为主。　　 ⑶采用切胶免疫的途径免疫BALB/c小鼠，采用30条尾蚴攻击感染，45天后解剖小鼠，计算减虫率和减卵率。结果显示，与佐剂组相比，rSiMLP/hsp70免疫小鼠的减虫率和减卵率分别为30.13％和26.60％。根据GenBank中Sjmlp/hsp70(AY813185)及SjGST26(FN321447.1)的序列信息，设计引物扩增SjLP/hsp70及SjGST26的ORF，进而将获得的目的基因定向插入到pcDNA3.1质粒中，成功构建了pcDNA3.1-SjMLP/hsp70、pcDNA3.1-SjGST26和pcDNA3.1-SjGST26-SjMLP/hsp70质粒。以上述重组真核质粒分别免疫BALB/c小鼠。结果显示，pcDNA3.1-SjMLP/hsp70和pcDNA3.1-SjGST26混合免疫小鼠的脾细胞IFN-γ分泌水平明显高于其他免疫小鼠；该组小鼠的减虫率和减卵率分别40.43％和58.59％，也明显高于其他免疫小鼠。　　 结论：①通过生物信息学分析，发现SjMLP/hsp70是定位在线粒体中的具有分子伴侣活性的蛋白；该基因能在正常尾蚴中转录；抗热休克实验证实SjMLP/hsp70蛋白具有提高E.coli抵抗热休克从而保护宿主菌的功能，而且证实该功能是通过具有完整结构的蛋白来实现的。②对重组蛋白rSjMLP/hsp70的免疫原性研究发现，该重组蛋白具有免疫原性，能诱导免疫动物产生较强的Th1及Th2型免疫应答反应，并能对日本血吸虫感染具有一定的保护力，提示该分子可能成为血吸虫病疫苗候选分子，具有进一步研究价值。③SjMLP/hsp70能协助GST26刺激小鼠脾细胞产生IFN-γ，提高免疫小鼠的保护性免疫水平，提示SjMLP/hsp70具有佐剂作用，而这种佐剂效能可能与SjMLP/hsp70的天然构像有关。