青稞β-1,3-葡聚糖酶的纯化、性质及抗体制备

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β-1,3-葡聚糖酶[EC 3.2.1.39]存在于大多数高等植物中。按植物种类、生理发育期或细胞定位的不同,认为存在一个同功酶家族,可按分子量、等电点、蛋白一级结构、细胞定位、作用方式分为多种类型。β-1,3-葡聚糖酶在细胞分裂,小孢子发生,胚发生等生理发育活动中起作用,且很有可能参与植物抵抗真菌的防御反应,是一类重要的与病程相关的蛋白(PR-2)。青稞是我国青海、西藏地区特有的高原耐寒作物,有报道认为青稞种子中含有较高的β-1,3-葡聚糖酶。 本实验将萌发的青稞种子经醋酸钠缓冲液抽提,50%~85%硫酸铵分级沉淀,DEAE-Cellulose 52,CM-Sepharose(Fast Flow)离子交换层析和Sephadex G-75分子筛层析,得到具活性的β-1,3-葡聚糖酶。SDS-PAGE检测显示分子量27 kDa左右的主带(95%)。以海带多糖为底物做酶学性质研究表明:纯化的β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度35℃,最适反应pH值范围5.0~5.5之间,Km为0.59mg/mL。β-1,3-葡聚糖酶是一种热敏感蛋白,随温度升高,酶活力下降。外加Ca2+对酶有激活作用,激活作用不明显,这与Manners D.J等报道的一致;pb2+对酶有抑制作用,且抑制效果明显。蛋白荧光光谱分析也表明金属离子可能与酶分子的侧链基团作用,使酶分子中的Trp和Tyr残基的微环境发生了改变。 本文还将纯化的β-1,3-葡聚糖酶对新西兰兔进行免疫制备抗血清,双向免疫扩散测定效价为1∶64。免疫印迹分析表明:制备的兔抗青稞β-1,3-葡聚糖酶抗血清能对青稞和小麦种子粗酶液中的27kDa β-1,3-葡聚糖酶进行特异性检测;另外,分别在青稞粗酶液67kDa处检测到1条微弱杂交带,小麦35kDa,67kDa处检测到2条杂交带,推测可能是粗酶液中存在相应分子量的与此β-1,3-
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