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体细胞核移植技术在医疗、农业及畜牧业等诸多领域有重要的应用价值。尽管利用该技术已经成功获得了多种克隆动物,但随之而来的克隆胚胎及个体成活率低、不同种属普遍存在的LOS(large offspring syndrome)等异常制约了体细胞核移植技术的广泛应用。目前,有许多学者认为不完全表观重编程是克隆效率低下的原因。本研究通过检测新生死亡克隆绵羊印记相关基因的DNA甲基化水平,探究克隆绵羊DNA甲基化的重编程程度。本研究主要采用重亚硫酸盐修饰测序法(BSP)和甲基化特异性PCR(MSP)法检测了2-3日龄死亡克隆蒙古绵羊肾脏、肺脏、肝脏、心脏和肌肉组织中8个印记相关基因的DNA甲基化水平与正常对照的异同,其中克隆个体羔羊2只,正常对照2只。此外,本研究进一步比较分析了Igf2r、Dlk1、Xist和Peg10在克隆绵羊D2和正常对照五种组织中的mRNA表达情况。在进行上述分析之前,本研究首先克隆了部分基因片段。通过实验得到如下结果:(1)本研究成功克隆到了绵羊Peg10 1163bp的拟DMR序列(GI:269838596),848bp绵羊Peg10部分cDNA序列(GI:285014443),764bp的绵羊Xist第一外显子5’端序列及483bp的cDNA序列(GI:285014445),307bp的绵羊Peg3第一外显子5’端序列。(2)绵羊Peg10 5’端CpG岛内205bp范围内区域为差异甲基化区域。(3)绵羊Peg3外显子5’端CpG岛内232bp范围内11个CpG二核苷酸对上的胞嘧啶在2-3日龄绵羊肾脏和肺脏中基本完全甲基化。(4)绵羊Cdkn1c外显子5’端CpG岛内188bp范围内19个CpG二核苷酸对上的胞嘧啶在2-3日龄绵羊肾脏和肺脏中基本非甲基化。(5)绵羊Dlk1转录起始位点上游CpG岛内188bp范围内17个CpG二核苷酸对上的胞嘧啶甲基化模式为马赛克式,该区域并非差异甲基化区域。(6)绵羊H19启动子区CpG岛内CTCF结合位点III附近121bp范围内6个CpG二核苷酸对上的胞嘧啶甲基化模式为马赛克式,该区域并非差异甲基化区域。(7)克隆绵羊D1、D2各组织各印记相关基因的DNA甲基化模式与正常对照基本相同,无明显差异,仅D2个别组织Dlk1甲基化水平略高于正常对照,D2 H19肝组织的甲基化水平高于对照。(8)克隆绵羊Xist MSP甲基化结果显示绵羊Xist分析区域可能为差异甲基化区域,而且克隆绵羊的甲基化模式与正常对照无显著差异。(9)半定量RT-PCR结果显示绵羊Xist和Igf2r基因表达基本无组织差异性,而Peg10的mRNA表达表现组织特异性,肾脏中表达水平强于其他组织。(10)Peg10和Dlk1在新生个体组织中的mRNA表达水平比其他检测基因弱。(11)克隆绵羊D2肾脏、肺脏、肝脏、心脏和肌肉组织中Xist、Peg10、Dlk1和Igf2r基因mRNA的表达水平与正常对照相比,差异不显著。综上,本研究认为2只体细胞克隆绵羊的DNA甲基化水平与自然生产绵羊无显著差别,即体细胞核移植克隆绵羊经历了比较完全的DNA甲基化重编程。同时,克隆个体上述基因的mRNA表达水平也未表现出明显异常,暗示体细胞核移植克隆绵羊经历了比较彻底地重编程。