青光眼是一种由视网膜神经节细胞凋亡导致的退行性视网膜神经性病变,是全球第二的致盲眼病。高眼压是青光眼重要的致病因素。房水产生与外排的失衡是导致高眼压的主要原因。房水由睫状体产出,通过位于虹膜与晶状体之间的缝隙而进入眼前房,通过房水外排途径排出眼睛。值得注意的是,80%-90%的房水外排阻力来自包括小梁网-Schlemm管在内的传统流出途径。小梁网细胞（trabecular meshwork,TM）凋亡和功能障碍被认为是眼压升高的主要原因。通过增加小梁网的流出功能来降低高眼压成为青光眼治疗的有效方法。但目前重塑受损的小梁网以及恢复房水的流出功能尚无有效的治疗措施。我们前期研究发现:来源于诱导性多能干细胞的小梁网细胞（iPSC-derived TM cell,iPSC-TM）可有效再生受损的小梁网组织,恢复并维持小梁网的房水外排功能。然而,iPSC-TM细胞移植后的存活率较低,影响了干细胞的应用进程。因此,维持iPSC-TM的长期治疗效果是一个挑战。当用间隙连接蛋白抑制剂CBX和FFA处理细胞时,iPSC-TM促进细胞增殖的作用减弱。前期研究提示,间隙连接,尤其是在小梁网组织高表达的Connexin43（Cx43）蛋白,或将成为提高干细胞组织重塑效果的新型治疗靶点。研究目的:本研究旨在探索间隙连接,尤其是小梁网细胞上高表达的间隙连接蛋白Cx43在iPSC-TM体外促进小梁网细胞分裂以及体内重塑受损的小梁网中的作用,以找到一种增强iPSCs对组织再生作用的方法,为青光眼的治疗提供新的治疗思路,探索新的治疗方式。研究方法:使用人的小梁网细胞的培养基将鼠的多能性干细胞诱导分化为小梁网的类似细胞。分化后的细胞通过q RT-PCR和免疫荧光鉴定TM细胞和干细胞生物标志物的表达。利用携带Cx43 shRNA的慢病毒下调iPSC-TM细胞中Cx43的表达。q RT-PCR和Western blot检测慢病毒侵染后细胞中Cx43的表达水平。在共培养体系中观察Cx43对iPSC-TM刺激TM细胞增殖的影响。为了进一步证实Cx43在以iPSC-TM为基础的组织再生中的作用,在C57BL/6J小鼠体内注射Ad5-MYOCY437H-EGFP病毒,建立小鼠高眼压模型,通过眼压计和组织学分析,检测眼压和TM细胞数以评价该模型。将低表达Cx43的iPSC-TM注入上述青光眼模型的前房中,与正常iPSC-TM组比较,通过IOP测量和TM细胞数分析,评价低表达Cx43的iPSC-TM组的治疗效果。研究结果:1.免疫荧光显示三种不同人来源的小梁网细胞和从小鼠前房提取的原代小梁网细胞（m TM）均高表达TIMP3和MMP3蛋白。通过免疫荧光分析,在人和小鼠的TM细胞中也可以检测到地塞米松诱导的myocilin蛋白上调,这是TM的共同特征。2.免疫荧光结果显示,分化后的iPSCs中TM生物标记蛋白TIMP3和MMP3高表达,而干细胞生物标记物Nanog和SOX2的表达水平降低;q RT-PCR结果显示从基因水平上来看,TIMP3在iPSC-TM细胞中的表达高于iPSC,而Nanog在iPSC-TM细胞中的表达低于iPSC,这些结果表明分化的细胞表现出类似TM的特征,干细胞特征减弱。3.携带Cx43 shRNA的慢病毒侵染iPSC-TM细胞后显示绿色荧光,表明iPSC-TM中成功侵染上了慢病毒。Western blot和q RT-PCR结果显示Cx43表达下调了约50%。通过共培养实验,敲低Cx43蛋白后,iPSC-TM刺激m TM分裂的作用减弱。4.前房注射Ad5-MYOCY437H-EGFP病毒后,小鼠眼压升高,小梁网细胞数目明显减少。该方法可以成功建立眼压升高、小梁网损伤的小鼠模型。5.与正常iPSC-TM处理组相比,Cx43低表达的iPSC-TM细胞降低小鼠的IOP作用减弱。此外,与正常的iPSC-TM的再生作用不同,iPSC-TM中Cx43的低表达不能增加移植后TM细胞的数量。研究结论:iPSC-TM在体外共培养的模型中促进m TM细胞的增殖,移植到高眼压的小鼠模型中,通过刺激内源性TM细胞分裂降低眼压以及恢复小梁网的功能,然而Cx43低表达显著影响了iPSC-TM的治疗效果。本研究表明Cx43作为细胞间通讯的重要蛋白,在基于iPSC-TM的小梁网再生中发挥积极作用,有望成为提高干细胞治疗青光眼效果的新型靶点,推动iPSC的临床应用。