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研究背景急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia)是一种以造血干细胞和髓系祖细胞异常增殖和分化为特点的恶性血液学疾病,可导致造血系统紊乱,抑制红、巨核系正常造血。该病主要表现为感染、出血、贫血并且可浸润皮肤、黏膜、淋巴结、脑脊液、脾脏等重要脏器或组织,起病急骤,病情恶化迅速,自然病程短。近年来,由于对该病的病理生理学过程有了更深刻的认识,使得新药大量涌现,造血干细胞移植技术不断进步及支持疗法的不断完善,显著提高了该病的缓解率及治愈率。但是,该病总生存率仍不足50%,这主要是由于患者原发耐药或者疾病复发最终演变为难治性白血病。MircroRNAs是在进化过程中高度保守的一类非编码RNA,多数起源于内含子,长度约为18-22nt。这些非编码RNA可以结合靶基因的mRNA引起后者降解或者翻译抑制,因此在基因转录后调控发挥着重要作用。在正常生理代谢过程中,这种调控是细胞增殖、分化、凋亡及维持细胞自稳态等细胞生命活动过程中的重要途径之一;与此同时,近几年的报道中发现microRNAs在恶性演变过程不但具有独特的表达模式,而且发挥着癌基因或抑癌基因的效应,因此也是影响肿瘤命运的关键要素之一。miR-204作为其中的一员,位于人类9号染色体q21瞬时受体电位离子通道蛋白 3(Transient receptor potential ion channel proteins-3)基因的第六内含子中。在多数肿瘤的发生中,该microRNA主要发挥抗肿瘤效应。已研究发现低表达miR-204在AML患者往往与较差的预后密切相关。由此,miR-204可作为AML独立的预后因素之一。另外,miR-204还可以靶向作用于BIRC6诱导AML细胞的凋亡且可以增强化疗敏感性。因此,提高miR-204的表达水平可能为AML患者带来新的福音。人类肝细胞因子(hepatocyte growth factor)是一种双链糖蛋白,可调控其靶细胞增殖、生存、移动及形态转变,主要行使细胞更新及组织修复等功能,编码该细胞因子的基因位于7号染色体的长臂(7q2111),其在细胞恶性演变的过程中发挥重要作用。已有报道在胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等实体瘤发现过度表达的HGF/c-MET通路并且与肿瘤进展及预后密切相关;在AML中,HGF可作用于PI3/AKT、MAPK/ERK信号通路促进AML细胞增殖、侵袭及迁移。因此,miR-204和HGF均与AML存在密切联系。然而,二者在AML中的关系及潜在分子调控机制仍需进一步明确。目的探讨miR-204与HGF在AML中的作用、关系及潜在的分子生物学机制,为AML的靶向治疗提供新的实验室依据。方法应用RT-qPCR技术测定AML患者和正常人骨髓单个核细胞及AML细胞株中miR-204和HGF的表达水平并进行相关性分析。应用western blot技术测定AML细胞株中HGF、c-MET、p-MET、c-myc等与HCF/c-MET通路相关的蛋白水平;Over-expression 及 Knock-dowm 技术调节 miR-204 及 HGF 在 AML细胞株中的表达水平;应用在线生物信息学预测软件对二者关系进行初步预测,构建HGF3’UTR野生型及突变型荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-204上调后荧光素酶活性的变化;MMT法测定细胞增殖能力、Annexin V/PI流式细胞技术测定细胞凋亡水平、Transwell法测定细胞的迁移及侵袭的能力。应用GraphPad8、SPSS 23.0、ImageJ将所得数据进行统计学分析。以Student’s t-test及单因素方差分析的方法分析两组与两组以上的差异,应用pearson法进行相关性分析,p值小于0.05认为差异具有统计学意义。结果1.miR-204与HGF在初治AML患者中的表达情况:1.1 miR-204在初治AML患者中的中位相对表达量(1.16643)显著低于正常对照组(2.231967)(p<0.05)。1.2 HGF在初治AML患者中的中位相对表达(1.712266)显著高于正常对照组(1.0285)(p<0.05)。1.3应用Pearson法将初治AML患者骨髓单个核细胞中miR-204与HGF的表达水平进行相关性分析,发现二者的相对表达量成负相关关系(r=-0.3666,p<0.05)。2.miR-204与HGF在AML细胞系中的表达水平2.1相比于人骨髓基质细胞HS-5,miR-204在Kasumi-1及HL-60细胞株中表达量均显著降低(p<0.05)。2.2相比于人骨髓基质细胞HS-5,HGF在Kasumi-1及HL-60细胞株中基因及蛋白水平的表达量均显著增高(p<0.05)。3.miR-204及HGF对AML细胞的生物学效应3.1实时荧光定量PCR结果证明miR-204 mimic可显著上调AML细胞miR-204的相对表达量;sh-HGF干扰载体可抑制HGF在AML细胞的基因及蛋白水平的表达。3.2 MMT法检测结果所示,miR-204上调后可抑制kasumi-1、HL-60的增殖活性,培养72h后抑制率分别为为44.7%和40.8%;下调HGF后可弱化AML细胞的增殖活性影响AML细胞生存,培养72h后生存率分别为53.5%和57.4%。3.3 Annexin V/PI双染法预染细胞并用流式细胞术测定AML细胞的凋亡水平,结果所示上调miR-204或下调HGF均可促进AML细胞的凋亡。3.4 Transwell法测定AML细胞迁移及侵袭能力的结果证实,上调miR-204或下调HGF可削弱Kasumi-1及HL-60细胞迁移和侵袭的能力。4.miR-204与HGF靶向关系的验证4.1 Western blot结果证明:在AML细胞中上调miR-204后,HGF蛋白表达水平显著降低,而应用miR-204 inhibitor下调miR-204可提高HGF蛋白的表达量。4.2应用在线生物信息学预测软件初步预测miR-204与HGF具有靶向关系,成功构建HGF 3’UTR端野生型及突变型荧光素酶报告基因质粒并于人胚肾293T细胞中进行双荧光素酶报告基因试验,结果证实HGF 3’UTR端存在与miR-204结合的预测靶点。5.miR-204靶向HGF对AML细胞生物行为的影响5.1 MMT法检测结果证实,miR-204可靶向作用于HGF抑制AML细胞的增殖活性。5.2 AnnexinV/PI双染法预染细胞并用流式细胞术测定结果说明,miR-204可靶向作用于HGF促进AML细胞凋亡。5.3 Transwell法结果证实,miR-204可靶向作用于HGF抑制AML细胞的迁移和侵袭的能力。6.在AML细胞中,miR-204靶向作用于HGF的分子生物学机制:Western blot结果说明miR-204靶向下调HGF的表达,但并不影响c-MET受体的表达水平,而是抑制c-MET受体的磷酸化水平及下游蛋白CyclinD1、c-myc、Bcl-2、Bax、MMP2和MMP9的表达,并且促进促凋亡蛋白BAX的表达;而在此基础上上调HGF后可恢复上述蛋白的表达水平。结论1.miR-204在AML患者骨髓中低表达,其可能的作用机制为通过抑制AML细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,发挥抗白血病效应。2.HGF在AML患者骨髓中呈高表达,可能与AML的发生相关。3.HGF为miR-204的靶基因,miR-204可靶向下调HGF影响HGF/c-MET通路及其下游蛋白的表达。4.miR-204靶向抑制HGF的表达,调节HGF/c-MET通路可能是其发挥抗白血病效应的关键要素之一。