目的:肝纤维化病变是多种原因所导致的中晚期肝脏疾病的共同病理过程,以肝小叶正常结构的破坏以及假小叶的形成为主要特征。肝纤维化的分子机制目前尚未被完全阐明,现有的研究认为静止期肝星状细胞(HSC)的异常活化以及细胞外基质的生成增加是导致纤维化的发生的主要原因。多种细胞因子及其信号通路均被证实参与了上述过程,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一类与细胞的生长,增殖,存活和分化等密切相关的生物因子。近年来,大量研究表明IGF-1与肝纤维化的发生发展密切相关,本实验的目的是研究IGF-1在大鼠肝纤维化病变过程中的表达情况以及传统中药(肝复康及其主要成分丹参)对其通路的干预作用。方法:整体实验:取健康Sprague-Dawley大鼠60只,雌雄随机,体重200~250g随机分为六组:正常对照组(C),模型组(M),肝复康治疗组(G),丹参治疗组(D),肝复康对照组(GC),以及丹参对照组(DC)。造模动物给予橄榄油稀释的10%四氯化碳5ml/kg皮下注射,每周2次,共8周;模型组持续CCL4皮下注射至第八周;正常及药物对照组采用相同方法皮下注射生理盐水。从第四周开始,药物对照组和治疗组分别进行肝复康(4.16ml/kg/天),丹参(2.5ml/kg/天)胃灌注,持续4周。于第8周末处死所有大鼠,并迅速采集肝脏标本储存于-80℃冰箱待用,分别用于切片制作和分子生物学实验。大体及病理学观察:大体观察各组动物活动状态,处死后取肝脏观察;常规HE染色法,观察不同组实验动物肝脏病理学改变。肝脏细胞外基质相关指标检测:逆转录PCR测定Ⅰ、Ⅲ型胶原(Collagen I,CollagenⅢ)。肝星状细胞活化的检测:免疫组化检测肝组织中α-平滑肌动蛋白(α-sma)的表达。检测大鼠肝组织中igf-1及通路相关基因的表达情况:分别用免疫组织化学方法检测相关靶蛋白igf-1的表达,逆转录聚合酶链式反应测定pi3k,细胞周期蛋白cyclind1表达水平。相关性分析:pearson法分析igf-1与pi3k,cyclind1,collagenⅠ,collagenⅢ,α-sma表达相关性。结果:(1)大体及病理学观察:造模组动物在精神状态及活动力上明显低于正常组,处死后肉眼观模型组大鼠肝脏体积明显增大,包膜紧张,油腻感;镜下可见模型组大鼠肝脏明显的纤维化样变,与正常对照组相比,模型组肝小叶结构破坏明显,肝细胞排列紊乱,假小叶形成,临近汇管区和小叶间肝细胞发生水肿,脂肪变性和坏死。在不同的治疗组中,肝脏纤维化损害均得到不同程度的改善。同时药物对照组与正常组在大体及形态学变化上无明显差异。(2)肝细胞外基质的检测:逆转录pcr结果提示,较之正常组,Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原均呈现明显上调表达;肝复康的灌注治疗使得上述因子表达情况不同程度的下降,结果具有统计学意义(p<0.05);而丹参组中亦能有效下调collagenⅠ基因的表达。同时上述指标在肝复康和丹参治疗组的比较结果具有统计学意义(p<0.05)。而与正常组相比,上述指标的表达在药物对照组中无明显差异。(3)肝星状细胞活化的检测:免疫组化结果显示,与对照组相比,α-sma的表达在模型组中明显上调,其阳性表达显著富集于纤维形成的小叶静脉周围细胞;而在不同的药物组中,同时可以观察到其阳性表达的改善(p<0.05)。两种药物对于α-sma阳性表达的改善效果具有统计学差异(p<0.05)。上述指标在药物对照组的表达与正常组相比无明显差异。(4)igf-1及其通路相关基因的表达:免疫组化结果显示,igf-1在正常组仅有少量表达;在药物对照组中未观察到明显差异。与之相比,模型组呈显著的阳性表达,且多位于细胞膜外;不同药物治疗组均改善了igf-1的上调表达(p<0.05)。在rt-pcr结果中,pi3k以及细胞周期蛋白d1在模型组中的表达较之正常组明显上调,两种药物的灌注治疗明显下调了PI3K和cyclin D1的表达。上述指标在不同药物组的对比中具有统计学差异。(5)相关性分析:IGF-1与PI3K,cyclin D1,CollagenⅠ,CollagenⅢ,α-SMA表达相关性的分析提示IGF-1与上述指标呈正相关性。结论:1在大鼠的肝纤维化发生过程中,IGF-1参与了肝星状细胞的激活以及细胞外基质的沉积从而加速肝纤维化。2中药肝复康和丹参对肝纤维化大鼠具有明确而显著的治疗效果,其机制可能与两种药物对IGF-1/PI3K/cyclin D1通路的抑制作用有关。而肝复康对其干预作用优于丹参。