研究背景肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤。由于环境污染、吸烟人数和吸烟量的增加,近几年来,世界各国肺癌的发病率和病死率逐年上升,在全世界范围,肺癌的发病率已高达70/10万,居恶性肿瘤的首位,在我国许多大城市,肺癌的发病率已居恶性肿瘤第一位。美国癌症协会的资料表明,每年癌症死亡的近50万病例中,约61%与原发性耐药发生有关,而约33%与获得性耐药有关,绝大多数因癌症死亡的患者直接或间接与耐药发生有关。顺铂是肺癌及其他肿瘤化疗中使用最为广泛的药物,然而由于癌细胞原发或继发的耐药性而疗效削弱,给临床治疗带来极大的困扰。肺癌耐药机制是由多因素、多因子参与的复杂生物过程,任何一种机制不可能完全解释肺癌耐药现象的发生,因此,有必要对肺癌耐药机制进行纵深研究。细胞的生长、分化、死亡是以特异的基因表达为基础,不同的基因表达造成了细胞生物学行为的差异,细胞表型由它所表达的基因种类、数量和时空顺序等因素所决定。已有肺癌的研究资料显示,不同病理类型、不同分化程度、不同临床分期、不同转移潜能的肺癌细胞基因表达谱存在差异。通过比较遗传背景相同,但耐药能力不同的肿瘤细胞间的基因表达差异,有可能从中筛选肿瘤耐药相关基因。人肺腺癌细胞株A549和耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/CDDP这两株细胞来自同一亲本,具有相同的遗传背景,两者间的差异主要表现在对顺铂的敏感和耐药性,适合于可比性研究,避免了标本取样的组织学差异,能够全面、准确地反映所筛选的各基因间的关系。因此,选择人肺腺癌细胞株A549细胞和耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/CDDP细胞为材料构建两者间差异表达基因谱,筛选差异表达基因,可初步确定肺腺癌顺铂耐药相关候选基因,探讨肺癌耐药机制。对顺铂敏感/耐药不同表型的肺腺癌细胞进行比较而筛选出的差异基因,只能初步提供这些基因可能参与了肺癌顺铂耐药性的基本信息,要进一步了解这些差异表达基因在肺癌顺铂耐药中所具有的作用,则必需研究它们对肺癌耐药性表型的具体影响,即基因功能研究。RNA干扰是近几年来生命科学中新兴起的一门技术,1998年由Fir等发现,是一种双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达使其沉默的过程,为一种序列特异性转录后沉默,能产生类似基因敲除效应。较传统方法有其特异性高、高效性、操作简单的独特优势。已成为基因功能研究的重要手段。筛选出的肺癌耐药相关差异表达基因,选择其中表达明显上调的基因,用RNAi技术封闭耐顺铂人肺腺癌细胞A549/CDDP细胞中该特异基因的表达,从体外实验证实该基因参与肺癌顺铂耐药的形成,同时,逆转其耐药性,为寻求提高肺癌铂类药物化疗效果的有效途径打下基础。本研究首先采用基因芯片技术,选择同一亲本的人肺腺癌细胞株A549细胞和耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/CDDP细胞为材料构建两者间差异表达基因谱,筛选出差异表达基因,初步确定肺腺癌顺铂耐药相关候选基因,探讨肺癌耐药机制,也为后续研究提供线索。通过基因芯片技术筛选获得了多个差异表达基因。通过检索既有文献中相关基因的报道,分析这些基因在肺癌顺铂耐药中的作用,我们选择了其中差异表达明显上调基因CDK7为目标进行后续研究。采用siRNA干扰技术特异性沉默CDK7,观察CDK7被干扰后对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/CDDP生物学特性的影响。进一步了解CDK7基因在肺癌顺铂耐药中所具有的作用,也为确定CDK7作为靶点,逆转肿瘤耐药研发药物提供依据。第一章应用基因芯片筛选肺腺癌顺铂耐药差异表达基因目的:构建人肺腺癌细胞株A549细胞和耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/CDDP细胞两者间差异表达基因谱,筛选差异表达基因,初步确定肺腺癌顺铂耐药相关候选基因。方法:提取人肺腺癌细胞株A549细胞和耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/CDDP细胞mRNA并反转录为cDNA,用cy5-dUTP和cy3-dUTP标记后与基因芯片杂交,然后用扫描仪ScanArray4000扫描芯片荧光信号图像,用基因图像分析软件GerePix 3.0对扫描图像进行数字化处理和分析。结果:筛选出与肺腺癌顺铂耐药关系相关的差异表达基因232个,有18种基因在耐药细胞中表达水平明显上调,有50种表达明显下调,对这些基因功能进行分类,可分为原癌基因和抑癌基因、DNA结合、转录和转录因子、细胞信号和传递蛋白、细胞受体、蛋白翻译合成、细胞骨架和运动、代谢发育相关基因以及未知功能基因。结论:（1）耐顺铂人肺腺癌细胞和人肺腺癌细胞基因表达有明显差异。（2）在耐顺铂人肺腺癌细胞和人肺腺癌细胞间有232个差异表达基因,这些基因按功能可分为原癌基因和抑癌基因、DNA结合、转录和转录因子、细胞信号和传递蛋白、细胞受体、蛋白翻译合成以及细胞骨架和运动、代谢发育相关基因以及未知功能基因。提示肺癌顺铂耐药机制是一个多基因、多因素的复杂生物过程。（3）筛选出的差异基因可能成为肺癌耐药相关基因。相关文献检索结果提示,CDK₇有作为肺癌耐顺铂相关基因的功能基础和可能。（4）基因芯片技术是一种高效、准确、大通量的基因研究方法,可用于肺癌基因表达水平研究。第二章人肺腺癌顺铂耐药差异表达基因CDK₇的验证目的:鉴定此前基因芯片技术筛选的人肺腺癌细胞株A549细胞和耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/CDDP细胞两者间差异表达基因谱结果可靠性。方法:应用实时荧光定量PCR方法检测CDK₇mRNA和Western blot法检测CDK₇蛋白在耐顺铂A549/CDDP细胞和对顺铂敏感的A549细胞中表达情况。结果:琼脂糖凝胶电泳显示:A549/CDDP细胞CDK₇ mRNA表达明显强于A549细胞CDK₇mRNA表达,两者比较差异具有统计学意义（p＜0.01）;western blot分析进一步显示A549/CDDP细胞CDK₇蛋白表达明显强于A549细胞CDK₇蛋白表达。结论:A549/CDDP细胞中CDK₇基因和蛋白水平明显高于A549细胞,提示CDK₇可能与A549细胞耐顺铂有关。为我们选择以CDK₇基因作为耐顺铂肺腺癌基因治疗和逆转顺铂耐药靶点提供强有力的依据。第三章CDK₇基因功能的初步研究目的:观察CDK₇被干扰后对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/CDDP生物学特性的影响。进一步了解CDK₇基因在肺癌顺铂耐药中所具有的作用,也为确定CDK₇作为靶点,逆转肿瘤耐药研发药物提供依据。方法:以CDK₇为靶标,构建CDK7基因siRNA真核表达载体,DNA质粒提取、测序,siRNA-CDK7转染A549/CDDP细胞,使用RT-PCR方法在A549/CDDP目的细胞中进行有效siNRA序列的筛选。细胞分组①A549组:A549细胞中加入lipofectmaine²⁰⁰⁰和2μg/mL CDK₇-siRNA2plasmid DNA。②对照组:A549/CDDP细胞中仅加入等量培基。③脂质体组:A549/CDDP细胞加入lipofectmaine²⁰⁰⁰。④siRNA组:A549/CDDP细胞加入lipofectmaine²⁰⁰⁰和2μg/mL CDK₇-siRNA2plasmid DNA。siRNA封闭CDK₇基因表达后,MTT法检测A549和A549/CDDP对顺铂的耐药指数;流式细胞仪检测对A549和A549/CDDP细胞周期的影响;RT-PCR和免疫细胞化学法检测siRNA封闭CDK₇基因表达对A549/CDDP肺癌耐药蛋白LRP mRNA和蛋白表达的影响。结果:（1）经MTT检测及计算,siRNA组A549/CDDP细胞对顺铂的半效抑制浓度IC₅₀为（66.69±8.746）μmol/L,对顺铂的耐药指数为3.79,对照组A549/CDDP细胞IC₅₀及耐药指数分别为（185.48±10.754）μmol/L和10.51倍,脂质体组A549/CDDP细胞对顺铂的半效抑制浓度IC₅₀为（182.53±9.625）μmol/L,对顺铂的耐药指数为10.39。A549组A549细胞对顺铂的半效抑制浓度IC₅₀为（16.62±5.216）μmol/L。siRNA组A549/CDDP细胞对顺铂的敏感性增加,耐药指数较对照组和空载体（脂质体）组明显下降,P＜0.01。siRNA组A549/CDDP细胞IC₅₀高于A549组,P＜0.01。与对照组相比,脂质体组的IC₅₀及耐药倍数均无明显改变,P＞0.05。（2）流式细胞学检测发现,siRNA组和A549组G₀/G₁期细胞所占比例明显增加,S期细胞和G₂/M期细胞所占比例明显下降,而对照组G₀/G₁期细胞所占比例明显降低,S期细胞和G₂/M期细胞所占比例明显增高,siRNA组和A549组G₀/G₁期、S期、G₂/M期细胞所占比例与对照组比较均有统计学意义（P＜0.01）;siRNA组和A549组细胞周期分布与对照组相似,脂质体组细胞周期分布与对照组相似。（3）RT-PCR和免疫细胞化学法检测发现,siRNA封闭CDK₇基因后,A549/CDDP细胞肺癌耐药蛋白LRP mRNA表达于24h开始降低,48h时降低最为明显,明显低于对照组（P＜0.01）;72h时开始增强,但仍低于对照组（P＜0.05）;48h时LRP mRNA表达与24h和72h时比较有统计学意义（P＜0.05）;脂质体组与对照组比较差别无统计学意义（P＞0.05）;免疫细胞化学法结果显示:siRNA组A549/CDDP细胞肺癌耐药蛋白LRP蛋白表达与基因改变一致,即于24h开始降低,48h降低最为明显,明显低于对照组（P＜0.01）;72h时开始增强,但仍低于对照组（P＜0.05）;48h时LRP蛋白表达与24h和72h时比较有统计学意义（P＜0.05）;脂质体组与对照组比较差别无统计学意义（P＞0.05）。结论:（1）CDK₇基因可能在肺腺癌顺铂耐药性产生中具有重要作用,CDK₇有作为肺癌顺铂耐药相关基因的可能。（2）CDK₇参与肺腺癌顺铂耐药机制,除影响细胞周期调控外,还可能通过耐药蛋白LRP途径参与顺铂耐药性产生。（3）通过RNA干扰可部分逆转CDK₇介导的人肺腺癌顺铂耐药性,为以CDK₇为目的基因的基因治疗,提供了实验依据。总结1、耐顺铂人肺腺癌细胞和人肺腺癌细胞基因表达有明显差异。2、在耐顺铂人肺腺癌细胞和人肺腺癌细胞间有232个差异表达基因,这些基因按功能可分为原癌基因和抑癌基因、DNA结合、转录和转录因子、细胞信号和传递蛋白、细胞受体、蛋白翻译合成以及细胞骨架和运动、代谢发育相关基因以及未知功能基因。提示肺癌顺铂耐药机制是一个多基因、多因素的复杂生物过程。3、CDK₇基因在肺腺癌顺铂耐药细胞中高表达,提示CDK₇可能与肺癌顺铂耐药相关。4、CDK₇参与肺腺癌顺铂耐药机制,除影响细胞周期调控外,还可能通过耐药蛋白LRP途径参与顺铂耐药性产生。5、通过RNA干扰可部分逆转CDK₇介导的人肺腺癌顺铂耐药性,为以CDK₇为目的基因的基因治疗,提供了实验依据。6、基因芯片技术是一种高效、准确、大通量的基因研究方法,可用于肺癌基因表达水平研究。