论文部分内容阅读
陆地棉作为重要的纤维和油料作物被广泛种植。研究陆地棉响应逆境的分子机制,对棉花生产具有重要的意义。植物在适应盐胁迫的过程中形成了复杂的转录调控网络,其中转录因子在转录调控过程起重要作用。关于MYB和GRAS转录因子家族基因参与植物盐胁迫响应过程已经有报道。本研究整合陆地棉盐胁迫相关转录组数据,筛选到受盐胁迫诱导上调表达的MYB家族基因Gh MYB73和GRAS家族基因GhSCL4,通过遗传分析和生化实验揭示其在植物响应盐胁迫过程的功能和调控机制。主要研究结果如下:1、Gh MYB73过表达可提高转基因植株耐盐性qRT-PCR实验表明Gh MYB73受NaCl和ABA诱导上调表达。亚细胞定位和转录激活实验表明Gh MYB73是一个具有转录激活活性的转录因子。通过遗传转化,获得了两个单拷贝的T1代Gh MYB73过表达棉花株系OE2和OE3,对大田中生长的OE2和OE3的成熟期根系表型进行观察,发现2个过表达株系的侧根数目均显著多于对照材料ZM24。观察Gh MYB73过表达株系盐胁迫表型,发现过表达株系的耐盐能力显著高于ZM24。VIGS实验表明Gh MYB73沉默植株对盐胁迫更加敏感。同时分析了Gh MYB73的T3代纯合转基因拟南芥的耐盐性,结果表明萌发期间,Gh MYB73过表达拟南芥株系在含有NaCl的MS培养基上的萌发率、绿色子叶展开率均显著高于野生型植株（WT）;此外,对拟南芥苗期的耐盐表型分析表明,和WT相比,转基因株系对盐胁迫的敏感性较低。因此,Gh MYB73是植物响应盐胁迫的正调控因子。使用甘露醇模拟渗透胁迫,发现在含甘露醇MS培养基上生长10天（d）后的Gh MYB73过表达株系的绿色子叶展开比例显著高于WT,与盐胁迫处理表型相似。盐胁迫环境下过表达植株中渗透调节物质脯氨酸含量和渗透胁迫响应基因At SOS3、At P5CS1和At NHX1的表达量均显著高于WT。因此Gh MYB73可以调节盐胁迫环境中渗透胁迫响应基因的表达,提高植物对渗透胁迫的耐受能力,从而增强植物的耐盐能力。相对于WT,Gh MYB73转基因株系植株对ABA的耐受性更强。盐胁迫环境下,ABA响应基因（At PYL8、At ABI5、At ABF3和At RD29B）在过表达植株中的表达量显著高于野生型拟南芥。酵母双杂和双分子荧光互补实验证明ABA受体Gh PYL8可以和Gh MYB73相互作用。因此Gh MYB73对盐的耐受性可能与ABA信号途径有关。2、GhSCL4过表达增强植物对盐和干旱胁迫的耐受性qRT-PCR实验表明GhSCL4是一个受盐和干旱胁迫诱导上调表达的基因。通过遗传转化获得了GhSCL4过表达拟南芥株系（OE1、OE2、OE3）,并通过NaCl模拟盐胁迫、甘露醇模拟渗透胁迫观察萌发期间转基因拟南芥对盐和渗透胁迫的耐受性。比较WT和过表达株系植株在含NaCl或甘露醇的MS培养基上的长势,发现转基因拟南芥在NaCl或甘露醇培养基上的绿色子叶比例均显著高于野生型拟南芥。通过VIGS技术在棉花中下调GhSCL4基因的表达,发现和对照植株相比,GhSCL4沉默植株离体叶片的失水率更高,并且GhSCL4沉默植株对盐和干旱的敏感性也更强。因此GhSCL4是植物响应盐和干旱胁迫的正调控因子。为了探索GhSCL4调控植物耐盐途径的分子机制,通过共表达网络分析筛选GhSCL4的共表达基因。GO富集分析表明,归类到钙离子结合途径的共表达基因数目最多。双分子荧光互补和虫荧光素酶互补实验表明GhSCL4和钙离子受体蛋白钙调素7（Gh Ca M7）相互作用。棉花中利用VIGS技术降低Gh Ca M7的表达量,结果表明Gh Ca M7沉默植株比对照植株更加敏盐。因此,GhSCL4可能通过与钙离子信号通路的Gh Ca M7结合调控钙离子信号途径响应盐胁迫,从而增强植株耐盐能力。此外,Bi FC实验证明Gh Ca M7可以和NO清除系统中的关键酶（亚硝基谷胱甘肽还原酶,Gh GSNOR）相互作用,推测棉花中GhSCL4与Gh Ca M7相互作用后,可以增强Gh Ca M7对Gh GSNOR酶活性的抑制作用,从而增加盐胁迫后植物体内NO水平,进而增强植物对盐胁迫的耐受性。