绿豆蛋白是一种植物源的杂豆蛋白,具有较高营养价值,其酶解得到的多肽具有良好的生物活性,是近几年的研究热点。锌是人体必需元素之一,锌离子在日常饮食中若摄入不足会引发多种疾病。近年来食源性蛋白肽微量元素螯合物因其天然、无毒副作用而被广泛关注。螯合物的结构稳定,进入人体胃肠道后不易产生沉淀从而能够被人体较好的吸收,但螯合物的结合模式和转运吸收的机制还需进一步深入探索与研究。实验以绿豆蛋白为原料,制备具有锌结合能力的绿豆多肽,纯化后对其螯合能力、结构性质及其生物利用率等进行研究,明晰其肽锌结合位点与生物活性。具体实验内容及结果如下:(1)绿豆多肽锌螯合工艺优化。以水解度和螯合能力为指标,对五种蛋白酶进行筛选。结果显示通过碱性蛋白酶是制备绿豆锌螯合肽的最佳蛋白酶;以螯合能力为指标,采用单因素和响应面结合的方法对螯合工艺进行优化,最佳工艺条件为:肽锌质量比为6.20:1,反应温度为50℃,反应时间为83 min,p H为6.3,此条件下螯合率达到52.11±0.51 mg/g。(2)绿豆蛋白肽的分离纯化。实验首先利用超滤的方法对绿豆蛋白肽进行分离,将其分为>10 KDa(P1),10 KDa~5000 Da(P2),3000 Da~5000 Da(P3),<3000 Da(P4)。分别在最佳螯合工艺条件下与锌离子进行螯合,结果显示P4的肽段的螯合能力最强为58.16±0.37%mg/g;利用体积排阻和高效液相色谱C18对P4进行纯化,纯化后螯合能力最佳,为80.82±0.49 mg/g。并通过LC-MS/MS对纯化后的肽段进行分析,结果显示匹配度最高的肽段分子质量为1192.56 Da,其氨基酸序列为Ser-Ser-Glu-Asp-Gln-Pro-Phe-Asn-Leu-Arg。(3)绿豆蛋白肽及其螯合物结构的分析。扫描电镜结果显示,多肽与螯合物在表面微观结构和结晶程度上均有较大改变;紫外光谱和傅里叶红外光谱分析表明,多肽的氨基、羧基与酰胺基参与了反应。(4)绿豆多肽锌螯合物的锌离子体外生物利用率实验。结果发现,在p H8.0时绿豆多肽锌螯合物锌离子的可溶率为72.30±0.54%,显著高于无机锌盐。此外,利用体外肠道消化模拟-透析法对绿豆肽锌螯合物的生物利用率进行研究。结果显示绿豆肽锌螯合物在模拟胃肠道中的溶解率和在肠道中的透析率分别为98.85±0.39%和44.24±0.73%均高于无机锌盐,说明螯合物在肠道中的吸收利用较好。(5)绿豆多肽锌螯合物细胞实验研究。采用Caco-2细胞模型,通过CCK8法检测细胞的存活率。以细胞学的角度探讨不同浓度绿豆蛋白肽对促锌离子转运吸收的影响。研究表明,促锌离子转运吸收最适的绿豆蛋白肽的浓度为0.4 mg/m L。对螯合物锌离子利用率进行测定,得到绿豆多肽锌离子的生物利用率为60.54±0.45%。