论文部分内容阅读
石杉碱甲（huperzine A,Hup A）为生物活性较强、可逆的乙酰胆碱脂酶抑制剂,无胆碱能毒性,用于改善认知障碍患者的认知功能。目前上市剂型有片剂、胶囊和注射液。石杉碱甲口服制剂具有胃肠道不良反应,且对于具有吞咽和记忆障碍的患者来说无法自主用药,而注射液则使用不便,需要医护监护。经鼻给药是脑靶向给药的一种途径,可以从嗅神经和嗅黏膜上皮绕过血脑屏障进入脑组织,但仅以溶液形式经鼻给药时,溶液剂难以进入中鼻道,大部分在鼻腔的后部沉积,同时易被鼻纤毛清除,存在生物利用度低的问题。将药物包载到脂质体中可以避免药物和鼻粘膜的接触,降低对鼻粘膜的刺激性,增强药物的稳定性,减慢其释放速率,达到缓释的目的。为了使脂质体具有主动靶向性,使用可以和脑细胞表面受体结合的乳铁蛋白（Lactoferrin,Lf）进行修饰,脂质体和乳铁蛋白结合后带有正电荷可以与带负电荷的鼻黏膜更好的接触,但脂质体以液体的形式经鼻给药,可能存在流失的问题,温敏凝胶（Thermosensitive Gel）具有较强的粘附行为,能够在生理环境下由液体形式变为不流动的半固体形式,可以防止液体药物的流失。因此再将乳铁蛋白修饰的脂质体制备成脂质体温敏凝胶,将制备的脂质体制剂经鼻给予大鼠体内,并腹腔注射给予大鼠石杉碱甲溶液（Huperzine A Solution,Hup A-Sol）,经鼻给予石杉碱甲溶液,灌胃给予石杉碱甲溶液为对照组进行大鼠体内药动学和脑靶向分析。目的:本课题拟制备乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体（Lactoferrin Modified Huperzine A Liposomes,Lf-Hup A-Lips）,通过乳铁蛋白的介导,达到将药物靶向输送至脑的目的。方法:1.使用高效液相色谱-紫外检测法建立石杉碱甲的体外分析方法,考察分析方法的精密度、回收率和稳定性。2.筛选了脂质体破乳的方法。比较了葡聚糖凝胶柱层析法,透析法两种测定脂质体包封率的方法。以包封率、载药量和粒径为指标,考察石杉碱甲脂质体的制备工艺,以单因素实验和响应面实验,筛选了脂质体制备的最佳工艺,以脂质体所带负电荷和乳铁蛋白所带正电荷进行静电结合,以结合后脂质体的粒径、电位和多分散系数为指标,筛选了乳铁蛋白和脂质体结合的最适浓度。并考察了乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体的包封率、载药量、p H值、粒径、电位、稳定性和体外释放度。3.通过冷溶法,以胶凝温度为指标制备了乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体温敏凝胶,并对温敏凝胶的外观、p H值和体外释放度进行了考察。4.以高效液相色谱-紫外检测法建立石杉碱甲的体内分析方法,对大鼠进行药动学实验,将大鼠分组,分别腹腔注射给予市售石杉碱甲溶液（Hup A-Sol）、灌胃给予石杉碱甲溶液（Hup A-Sol）,经鼻给予石杉碱甲溶液（Hup A-Sol）、经鼻给予石杉碱甲脂质体（Hup A-Lips）、经鼻给予乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体（Lf-Hup A-Lips）和经鼻给予乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体温敏凝胶（Lf-Hup A-Lips-Gel）,均在0.03 h、0.08h、0.25 h、0.5 h、1h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h和48 h后,将大鼠摘眼球取血,解剖取脑组织,用乙腈作为蛋白沉淀剂,并用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液碱化,用乙酸乙酯作为萃取剂对血清和脑组织进行处理,将处理后的样品用流动相复溶,用高效液相色谱测定药物在血清和脑组织中各个时间点的浓度,用PKSolver药动学软件计算各制剂在血清和脑组织中的药动学参数,以Spass软件对数据进行方差分析,以脑靶向指数评价给药制剂的脑靶向性。结果:1.建立了石杉碱甲体外高效液相色谱-紫外分析方法,该方法的线性、精密度和稳定性均良好,可用于石杉碱甲的体外分析。2.选择曲拉通水溶液为脂质体的破乳剂。通过两种包封率方法的比较,选用透析法作为测定脂质体包封率的方法,透析平衡时间为8 h,游离药物的加样回收率均大于95%,经单因素和响应面实验设计得到脂质体的最佳制备工艺为蛋黄卵磷脂120 mg,胆固醇13 mg,用3 m L乙醇溶解磷脂膜材,将溶解后的有机相用注射器缓缓注入0.3 mo L·L-1的硫酸铵水溶液中,置50℃水浴中磁力加热搅拌90 min挥尽乙醇,冰水浴超声30 min,用0.22μm的微孔滤膜过滤,取空白脂质体在12 h内透析,每隔3 h换一次透析液,取透析后的空白脂质体,加入石杉碱甲药物粉末4 mg,43℃水浴中磁力搅拌孵育15 min。乳铁蛋白和脂质体通过静电结合的最适浓度为75 mg·m L-1。3.当加入16%的泊洛沙姆407和4%的泊洛沙姆188时,乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体温敏凝胶的相变温度为35.80±0.40°C。4.建立了石杉碱甲的体内高效液相色谱-紫外检测法,该方法的专属性、精密度、稳定性和回收率均良好。用PKSolver软件计算出腹腔注射Hup A-Sol、灌胃Hup A-Sol、经鼻Hup A-Sol、经鼻Hup A-Lips、经鼻Lf-Hup A-Lips和经鼻Lf-Hup A-Lips-Gel的药动学参数。血清药动学实验结果表明,与腹腔注射Hup A-Sol组和经鼻Hup A-Sol相比较,脂质体制剂组具有缓释作用。灌胃组石杉碱甲的血清和脑组织中AUC0-t低于本实验所有给药组,经鼻给药组在血清中AUC0-t均大于腹腔注射Hup A-Sol给药组和灌胃Hup A-Sol给药组,脑组织中经鼻Hup A-Sol、经鼻Hup A-Lips和经鼻Lf-Hup A-Lips组的AUC0-t大于腹腔注射溶液组和灌胃Hup A-Sol,通过脑靶向指数DTI表明,经鼻Lf-Hup A-Lips与腹腔注射Hup A-Sol和经鼻Hup A-Sol相比较均具有脑靶向性。结论:制备了乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体经鼻给药制剂,其体外释放度表明与溶液剂相比具有缓释作用,体内药动学表明,与腹腔注射石杉碱甲溶液和经鼻石杉碱甲溶液相比,乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体经鼻给药具有脑靶向性。为开发石杉碱甲新剂型和新的给药途径提供了参考。