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背景和目的:糖尿病早期内皮/肾小球高通透性(Endothelial/glomerular hyperpermeability)是早期糖尿病肾病(Diabetic nephropathies,DN)重要的病理生理改变,可是我们对其发生机制仍然一筹莫展。已经知道高糖、晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)、内皮源性一氧化氮(NO)产生减少、炎症及氧化应激等多种因素可促进肾小球内皮细胞的通透性,但这些因素最终是通过改变内皮细胞的屏障功能实现的,因此有必要研究内皮屏障稳定调控的关键机制,才能找到DN的治疗靶点。ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,ARFs)是真核细胞中广泛表达且高度保守的GTP结合蛋白,是Ras超家族成员之一。Arf6作为ARFs一种特殊亚型,定位于质膜和内涵体膜上。与其它小分子GTP结合蛋白一样,Arf6在有活性的GTP和无活性的GDP两种结合构象之间转换,其中Arf6-GDP到Arf6-GTP的转换需要鸟苷交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)的催化;而Arf6功能失活,即Arf6-GTP水解为Arf6-GDP则需要GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins,GAPs)的催化。Arf6的生物学功能主要包括调控细胞膜泡运输、细胞膜与骨架的重排、细胞通透性等多种细胞膜生理活动。ARNO(ARF nucleotide-binding-site opener)是目前报道最多的催化Arf6的GEF蛋白。ARNO的高表达可上调Arf6的活性,促进细胞膜表面血管内皮钙依赖性黏附分子(vascular endothelial cadherin,VE-Cadherin)等连接蛋白转移至胞内,进而破坏胞间连接、增加内皮通透性。许多炎性因子都可以影响ARNO/Arf6信号进而破坏内皮的通透性。如白细胞介素-1(IL-1)刺激内皮细胞高通透性与ARNO/Arf6通路活化有关。内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)刺激内皮细胞的迁移及成管能力与Arf6活性有关。VEGF165及纤黏蛋白(Fibronectin,FN)诱导的内皮细胞迁移及渗漏也与Arf6活性增加有关,应用ARNO抑制剂能够逆转上述作用。在糖尿病的微环境下,大量炎性细胞激活、聚集,炎性因子高度表达,因此我们猜想,DN的微环境激活了ARNO/Arf6通路,进而破坏肾小球内皮屏障稳定性,导致蛋白的渗漏、蛋白尿的产生,因此有必要研究ARNO/Arf6信号通路在DN中的作用。本课题应用AGEs处理人肾小球内皮细胞(Human renal glomerular endothelial cells,HRGECs)、ARNO siRNA或Arf6 siRNA转染的HRGECs,观察AGEs对内皮ARNO表达、Arf6活性和内皮通透性的影响,探讨ARNO/Arf6信号通路在AGEs诱导的内皮高通透性中的作用,旨在提出AGEs诱导肾小球内皮屏障失稳定性的机制,为今后筛选治疗糖尿病肾病的药物提供理论依据。方法:本课题分为3部分进行研究。第一部分:AGEs对HRGECs ARNO/Arf6通路及细胞通透性的影响体外培养HRGECs,分别进行AGEs浓度依赖(20、40、60、80μg/ml AGEs刺激24h)及时间依赖(80μg/ml AGEs刺激6、12、24和48h)实验,Real-time RCR和Western blotting分别检测ARNO m RNA和protein表达,pulldown assay检测Arf6活性(Arf6-GTP),并进行FITC-Dextran(40kDa)内皮通透性检测。第二部分:ARNO沉默对AGEs诱导HRGECs细胞通透性的影响将携带ARNO siRNA的重组慢病毒转染入HRGECs并以AGEs刺激后,Real-time RCR和Western blotting分别检测ARNO mRNA转录和protein表达、细胞膜VE-Cadherin表达,pulldown assay检测Arf6活性(Arf6-GTP)和Rac1活性(Rac1-GTP),并进行FITC-Dextran(40kDa)内皮通透性检测。第三部分:Arf6沉默对AGEs诱导HRGECs细胞通透性的影响将携带Arf6 siRNA的重组慢病毒转染入HRGECs并以AGEs刺激后,Real-time RCR和Western blotting分别检测ARNO及Arf6 mRNA转录和protein表达、细胞膜VE-Cadherin表达,pulldown assay检测Rac1活性(Rac1-GTP),并进行FITC-Dextran(40kDa)内皮细胞通透性检测。结果:第一部分:AGEs浓度依赖实验中,AGEs浓度依赖性增加HRGECs ARNO mRNA转录和protein表达(P<0.05)。同样,AGEs浓度依赖性增加HRGECs Arf6活性和内皮细胞FITC-Dextran通透性(P<0.05)。与浓度依赖实验相似,AGEs时间依赖实验中,AGEs时间依赖性增加HRGECs ARNO mRNA和protein表达(P<0.05)。同样,AGEs时间依赖性增加HRGECs Arf6活性和内皮细胞FITC-Dextran通透性(P<0.05)。第二部分:以携带ARNO siRNA的重组慢病毒将HRGECs ARNO基因沉默后,AGEs刺激诱导的Arf6活性、Rac1活性和内皮细胞通透性均显著降低,细胞膜VE-Cadherin表达显著增加(P<0.05)。第三部分:以携带Arf6 siRNA的重组慢病毒将HRGECs Arf6基因沉默后,AGEs刺激诱导的Rac1活性和内皮细胞通透性均显著降低,细胞膜VE-Cadherin表达显著增加(P<0.05),而ARNO表达无变化。结论:1.AGEs诱导的HRGECs高通透性与ARNO/Arf6信号活化有关。2.抑制ARNO/Arf6信号通路有望成为治疗糖尿病肾病肾小球内皮高通透性的新方向之一。