研究背景骨肉瘤是起源于间叶组织的恶性骨肿瘤,多发于儿童和青少年。现阶段大剂量的化疗是主要的治疗方法,该方法虽有效但无选择性,当化疗药物进入机体后,对正常的组织细胞亦有杀伤作用,引起了很严重的副作用。因此,增强化疗药物针对骨肉瘤组织的靶向性,成为目前急待解决的一个课题。肿瘤的血管生成是肿瘤发展的重要环节,肿瘤的生长乃至扩散很大程度上依赖于新生的血管系统提供的营养,因此将肿瘤新生血管内皮上的某些特异性分子作为药物作用的新靶点,日益受到研究者的密切关注。为了获取能与上述靶点特异性结合的配体,必须具备有效的筛选手段。噬菌体展示技术的应用为实现此目的提供了一个全新的工具。噬菌体展示技术是20世纪90年代发展起来并得到广泛应用的新技术。采用该技术,可以在欲筛选的靶标分子结构不明确的情况下,根据它们之间相互作用的区域及相互作用的性质来进行筛选,从而筛选出一些能与靶分子结合的特异性短肽。本课题组成员管明强于2009年利用鼠骨肉瘤细胞UMR-106制作骨肉瘤荷瘤裸鼠模型,然后利用噬菌体7肽肽库进行体内筛选,得到一条能特异性结合UMR-106骨肉瘤血管内皮细胞(OAVECs)的七肽(序列为：TKPDKGY),并将表达该序列的噬菌体克隆进行体内回输验证发现,该克隆在裸鼠骨肉瘤组织的聚集显著高于其它正常组织,免疫组化亦显示该克隆可在骨肉瘤血管内皮表面大量聚积,而在心脏、肺脏、肾脏及脑组织内仅有少量的聚积,该七肽具有明显的鼠骨肉瘤血管内皮细胞特异亲合性,本课题组成员杨澜波根据上述筛选出的噬菌体克隆的表面蛋白的氨基酸序列,合成七肽(序列为：TKPDKGY),并结合荧光基团FITC,从动物和细胞两个水平检测出该七肽与骨肉瘤血管内皮细胞有着较好的靶向特异性。上述研究结果为本阶段实验的顺利进行奠定了良好的基础。Tumstatin是继endostatin和angiostatin之后最新发现的来源于血管基底膜Ⅳ型胶原&3链非胶原区的244个氨基酸组成的大分子蛋白,其作用机制是通过结合细胞表面整合蛋白avB3对内皮细胞的生长和凋亡起到调节作用。2001年Maeshima及其同伴发现该肿瘤抑素内的一些氨基酸多肽能够发挥全长肿瘤抑素抑制血管内皮细胞的作用。其中以T3肽和T7肽的抑制作用最为明显。国内外的另一些实验中也证实肿瘤抑素相关肽对卵巢癌、肝癌等恶性实体肿瘤以及内皮细胞有广泛的抑制作用。但是肿瘤抑素的相对分子量较大,本身还是肺肾出血综合症的自身抗原,对正常的脉管系统会产生一定的毒副作用。为了获取活性更高,分子质量小,治疗效果更好,同时提取更方便无毒副作用的抗肿瘤活性肽,我们以上述本课题组筛选出的骨肉瘤血管特异性结合七肽为载体,整合肿瘤抑素活性T3片段,研究该重组合成肽对荷骨肉瘤裸鼠的抑瘤效果。以期使靶向-T3肽更好地富集在肿瘤部位,减少毒副作用,从而发挥更强的抗骨肉瘤效果。目的通过整合骨肉瘤特异性结合七肽与tumstatin活性片段T3肽,使重组靶向-T3肽在骨肉瘤治疗方面发挥更高效低毒的治疗效果。方法1.肿瘤抑素T3肽、靶向-T3肽合成及荷瘤裸鼠模型制备使用先进的微波快速多肽合成仪器,按照两条肽链的氨基酸顺序进行合成,合成完毕后,用高效液相的方法对其进行分离及纯化。2.重组合成肽体外抑制实验通过细胞增值抑制实验(MTS法)及细胞迁徙抑制实验(划痕实验)检测人工合成的两条肽段对人脐静脉内皮细胞的抑制活性。3.重组合成肽体内抑瘤实验荷瘤裸鼠模型制备完成后,将其分为四组,每组6只,分别给予T3肽、重组靶向-T3肽、化疗药CTX及相同容积的缓冲盐溶液,治疗14天,通过比较肿瘤体积增长情况、瘤重、肿瘤血管相关的生长因子(VEGF)、肿瘤肺部转移情况来检测重组靶向-T3肽对骨肉瘤的体内抑制作用。结果1.肿瘤抑素T3肽、靶向-T3肽合成及荷瘤裸鼠模型制备肿瘤抑素T3肽及靶向-T3肽制备并纯化完毕后使用System Gold HPLC(色谱柱：Kromasil,美国贝克曼公司)进行纯度检测,结果显示：单纯肿瘤抑素T3肽及重组靶向-T3肽纯度分别为95.11%和95.19%。在皮下接种骨肉瘤细胞悬液两周后,对肿瘤进行体积测量,选取24只肿瘤体积为100mm3±20mm3的荷瘤裸鼠做为实验对象。2.重组合成肽体外抑制实验细胞增殖抑制实验：通过MTS法得出单纯T3凋亡肽及靶向-T3.肽均对人脐静脉内皮细胞株有较明显的抑制作用。细胞迁徙抑制(划痕修复)实验：T3肽及靶向-T3肽均对内皮细胞的迁徙起到明显的抑制作用,可减慢内皮细胞的爬行迁徙速度。而这两种肽对内皮细胞在体外的迁徙抑制作用并无显著差异。3.重组合成肽体内抑瘤实验肿瘤体积增长曲线：用药后除化疗药物组荷瘤裸鼠骨肉瘤体积有缩小趋势之外,其余三组骨肉瘤体积仍继续增大。治疗完成后,化疗药物组、T3肽治疗组、靶向-T3肽治疗组、PBS组体积有显著统计学差异(F=159.8p=0.000)。并且相同剂量下靶向-T3肽治疗组肿瘤体积显著小于T3肽治疗组。骨肉瘤生长抑制率：治疗完成后完整剥离肿瘤组织称重,方差分析结果显示各治疗组肿瘤重量有显著统计学差异(F=16.353 p=0.000)。经多组数据之间的两两比较(LSD法)显示T3肽组与靶向-T3肽组肿瘤重量有显著差异(P=0.045)。血管内皮生长因子：各治疗组肿瘤组织内血管内皮生长因子VEGF阳性积分均低于空白对照组。同一药物浓度治疗条件下,经非参数检验,四个治疗组VEGF表达有显著统计学差异(X2=11.095 P=0.011)。靶向-T3肽组平均秩次为26.56,而T3肽组平均秩次为39.31。骨肉瘤肺部转移率：靶向-T3肽治疗组骨肉瘤肺部转移率为33%,低于肿瘤抑素T3肽治疗组及化疗药物治疗组。而PBS组的荷瘤裸鼠两周内骨肉瘤肺部转移率为100%。结论本研究在已获得骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合肽并鉴定了其与骨肉瘤血管内皮细胞靶向结合性的基础上,以该骨肉瘤血管特异性结合肽为载体,整合肿瘤抑素活性T3片段,从体外体内两个水平研究了该重组靶向-T3肽对荷骨肉瘤裸鼠的特异性抑瘤效果。经过骨肉瘤靶向性短肽的介导,该重组靶向-T3肽较单纯的T3片段能够更好地富集在肿瘤部位,减少毒副作用,发挥更强的抗骨肉瘤效应。通过以上研究,我们得出以下几点结论：1.成功复制了骨肉瘤荷瘤裸鼠模型。2.重组靶向-T3肽对骨肉瘤有较好的靶向结合性。从治疗效果方面可证明骨肉瘤血管内皮细胞是此重组靶向-T3肽的靶向细胞。3.在骨肉瘤血管特异结合肽TKPDKGY的介导下,肿瘤抑素T3活性肽段的抗骨肉瘤活性明显提高并更高效率地抑制骨肉瘤的肺部转移。4.相对于T3而言,靶向-T3肽可减少对非肿瘤部位血管的抑制作用,减少了毒副作用。