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灰树花（Grifola frondosa）,又名栗子蘑、云蕈、舞茸等,隶属无隔担子菌亚门（Nonseptate eumycota）,层菌纲（Class fungi）,多孔菌科（Polyporaceae）,树花属（Ramalina）,是珍贵的食药两用真菌之一。灰树花富含多糖、蛋白质和膳食纤维等多种营养成分,具有免疫调节、抗氧化和抗肿瘤等生物活性,其中,多糖为其主要的生物活性物质。近年来,双水相萃取技术因萃取条件温和、选择性强、不引起生物活性物质失活或变性,且不存在有机溶剂残留等特点,已广泛应用于多糖、蛋白等天然产物的分离和纯化。目前,双水相萃取技术在灰树花多糖分离、纯化等方面尚未见报道,因此本文采用双水相体系分离灰树花多糖并利用响应面法优化其分离工艺;采用GC-MS、FT-IR等方法对双水相体系纯化后灰树花多糖进行结构表征;采用化学抗氧化和细胞抗氧化方法研究纯化后灰树花多糖的体外抗氧化活性,为双水相体系分离灰树花多糖的研究及应用提供理论基础。本论文分为三个部分,主要研究内容和结果如下:第一部分双水相体系分离灰树花多糖工艺研究采用乙醇-硫酸铵双水相体系分离灰树花多糖,单因素法和响应面法研究硫酸铵浓度、乙醇浓度、温度、pH等因素对灰树花多糖收率的影响。单因素实验结果表明乙醇-硫酸铵双水相体系分离灰树花多糖的最佳条件为:硫酸铵浓度为18%,乙醇浓度为30%,温度为30℃,pH为4。响应面实验结果表明,在30℃下,乙醇-硫酸铵体系分离灰树花多糖的最佳工艺为:硫酸铵浓度为17%,乙醇浓度为27.9%,pH3.22。此条件下,灰树花多糖的收率为90.21%,纯度为66.7%,与预测值接近。第二部分灰树花多糖结构鉴定及初步表征采用FT-IR、GC-MS、CD、SEM、AFM和刚果红实验等研究乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后灰树花多糖的结构特征。FT-IR结果表明:双水相体系纯化后灰树花多糖为吡喃糖环构型。GC-MS结果表明:灰树花多糖是由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,其单糖摩尔比为1.3:1.0:5.1:1.0。刚果红实验结果表明:灰树花多糖存在三螺旋结构,且外界条件的改变可影响其三螺旋结构。圆二色谱实验表明:灰树花多糖存在不对称结构,且外界条件的改变可影响其对称性结构。扫描电子显微镜结果表明:灰树花多糖呈相互交织的网状结构。原子力显微镜结果表明:灰树花多糖链相互缠绕,以团聚状形式存在。可见乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后灰树花多糖为三螺旋不对称结构。第三部分灰树花多糖抗氧化活性测定采用化学抗氧化和细胞抗氧化方法研究乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后灰树花多糖的抗氧化活性。结果表明,双水相体系纯化后灰树花多糖能够有效清除ABTS+、DPPH·和·OH,抵抗脂质过氧化反应,在灰树花多糖浓度为5000μg/mL时,对ABTS+、DPPH·和·OH清除率分别为70.43±2.01%、47.17±1.98%和38.49±1.07%,抗脂质过氧化率为55.39±1.79%;与H2O2模型组相比,在实验浓度范围内,灰树花多糖浓度大于等于600μg/mL时,细胞内ROS含量显著降低（P<0.05）,细胞内MDA水平极显著降低（P<0.01）,细胞内LDH释放量极显著降低（P<0.01）;灰树花多糖浓度大于等于100μg/mL时,细胞内SOD含量显著增加（P<0.05）,灰树花多糖浓度大于等于600μg/mL时,细胞内GSH-PX含量显著增加（P<0.05）,灰树花多糖浓度为1000μg/mL时,细胞内CAT含量显著增加（P<0.05）。可见,乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后灰树花多糖有较强的体外抗氧化活性。综上所述,本文基于双水相体系分离纯化灰树花多糖并采用响应面法优化其分离工艺,初步表征了纯化后灰树花多糖的结构,通过化学抗氧化和细胞抗氧化方法研究其体外抗氧化活性,为双水相体系分离灰树花多糖的研究及应用提供了理论基础。