【摘 要】
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本实验采用的实验材料——中国马褂木和北美鹅掌楸,分别取自从中国及北美各地引种到南京林业大学下蜀林场的30多年种源实验林,以及南京林业大学校园内的纯种鹅掌楸优良单株。以新梢及花苞为材料进行原生质体分离和融合的实验研究。主要结果如下:1.外植体的灭菌中国马褂木和北美鹅掌楸优良单株春天抽芽后15天发出的幼嫩芽、嫩枝、嫩叶、叶柄为材料较好,花苞选取花瓣45cm长的较好,其适宜的灭菌处理为:将采摘的嫩枝用洗
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本实验采用的实验材料——中国马褂木和北美鹅掌楸,分别取自从中国及北美各地引种到南京林业大学下蜀林场的30多年种源实验林,以及南京林业大学校园内的纯种鹅掌楸优良单株。以新梢及花苞为材料进行原生质体分离和融合的实验研究。主要结果如下:1.外植体的灭菌中国马褂木和北美鹅掌楸优良单株春天抽芽后15天发出的幼嫩芽、嫩枝、嫩叶、叶柄为材料较好,花苞选取花瓣45cm长的较好,其适宜的灭菌处理为:将采摘的嫩枝用洗衣粉溶液洗15分钟,用清水冲洗2小时,用酒精处理30秒,再用升汞处理9分钟,用灭菌的清水冲洗45次,接种到诱导培养基上。2.愈伤组织的诱导中国马褂木和北美鹅掌楸初代培养基均以MS为佳。其中嫩芽、嫩枝、幼叶、幼叶叶柄适宜诱导培养基为MS+2,4-D2.0mg/L+6-BA0.2mg/L+SUC30g/L,其愈伤诱导率能达到100%;花药愈伤组织的诱导培养基为: 1/2MS+ 2,4D2mg/L+ 6-BA0.5mg/L+ NAA2mg/L+ KT0.2mg/L+ GA0.2mg/L+ Gln 200mg/L+ Asn200mg/L+ Pro100mg/L+ Arg200mg/L+ CH300mg/L。3.悬浮体系的建立愈伤组织经过培养基MS+ NAA0.5mg/L+ KT0.5mg/L+ 6-BA0.5mg/L+ Vc5mg/L+ LH500mg/L+ pH5.8+ SUC50g/L上培养,可诱导出胚性愈伤组织。4.原生质体的游离和培养确定叶肉原生质体分离的适用酶液组合为E组合:纤维素酶Cellulase2%+半纤维素酶Hemicellulase1%+果胶酶PectolyaseY-23 0.2%;确定悬浮细胞分离的适用酶液组合为F组合:纤维素酶Cellulase2%+半纤维素酶Hemicellulase1%+果胶酶PectolyaseY-23 0.1%。原生质体的培养基为KM8p,添加0.6mol/L的甘露醇,以及0.1%的MES。5.原生质体的电融合处理电融合的适宜参数为:AC强度110V/cm,时间30秒;直流脉冲,作用时间选择为40μs,作用强度为1000V/cm,作用次数为5次。原生质体融合率最高可达到30%以上。6.外源DNA的转化外源质粒DNA与原生质体的混合液,经过逐步添加PEG溶液（30%PEG-8000+ 0.3mol/L葡萄糖+10mmol CaCl2）,可以使质粒DNA所携带的目的基因GFP瞬时表达。
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