紫丹参寡糖、多糖和玫瑰花多糖的结构表征及其抗胰腺癌活性研究

来源 :遵义医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chengl1987
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目的:从紫丹参(Salvia yunnanensis)和玫瑰花(Rosa rugosa)中探索具有抗胰腺癌细胞生长活性的多糖,并对其进行结构解析。为基于紫丹参和玫瑰花中抗胰腺癌活性物质基础多糖的探究及其相关质量控制研究以及基于多糖的创新药物研究奠定理论与物质基础。方法:采用沸水提取,95%乙醇沉淀法对紫丹参和玫瑰花多糖进行提取。粗多糖经DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱分离纯化后,进一步运用凝胶柱Bio-Gel P2纯化得到均一级分。采用硫酸苯酚法、间羟基联苯比色法、BCA法以及用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法对各多糖的理化性质进行测定。运用HPLC柱前衍生法测定单糖组成。综合运用气质联用(GC-MS)、质谱和核磁共振分析等对多糖的化学结构进行精细解析。运用了三氧化硫吡啶法对Z0P21寡糖进行了硫酸化得到硫酸寡糖SZ0P21。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测多糖抗胰腺癌作用和安全性,运用SPR技术检测Z0P21与Galectin-3相互作用,使用HMEC-1微血管内皮细胞的管腔形成实验考察紫丹参寡糖及其硫酸化衍生物的抗血管生成能力。结果:从紫丹参(4.5 kg)中获得水提粗多糖(160.3 g,得率为3.56%)。紫丹参水提粗多糖经DEAE SepharoseTM Fast Flow柱分别以0 M、0.05 M、0.1 M、0.2 M和0.4 M Na Cl洗脱,得到五个次级多糖组分,分别为:ZDS0(6.3 g,得率为1.755%)、ZDS05(141.4 mg,得率为0.003%)、ZDS1(352.6 mg,得率为0.008%)、ZDS2(535.6 mg,得率为0.013%)、ZDS4(241.8 mg,得率为0.005%)。ZDS0经Bio-Gel P2凝胶柱纯化得到均一寡糖Z0P21(400.28 mg,得率为0.96%)。经ESI-MS检测紫丹参寡糖Z0P21的分子量为666 Da,糖组成分析表明该寡糖主要由葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)组成,摩尔比为31.10:68.90,是一葡萄半乳低聚糖。甲基化分析表明Z0P21寡糖中半乳糖残基连接方式为α-1,6-D-Gal,葡萄糖残基为末端连接方式(T-Glc),摩尔比为72.49:25.88。结合其糖组成、甲基化、质谱、和核磁共振图谱分析结果,我们推导出该寡糖为由三个半乳糖和一个葡萄糖末端组成的直链四聚糖。将Z0P21进行硫酸化后得到硫酸化寡糖SZ0P21,氯化钡-明胶法检测其取代度为0.98。从玫瑰花(4.5 kg)中获得水提粗多糖(261.2 g,得率为5.80%)。玫瑰花水提粗多糖经DEAE SepharoseTMFast Flow柱分别以0 M、0.05 M和0.4 M Na Cl洗脱后得到三个次级多糖分别为:REP0(4759.2 mg,得率为0.085%)、REP05(1088.9 mg,得率为0.005%)、REP4(8274.0 mg,得率为0.069%)。REP4经Bio-Gel P2凝胶柱纯化得到均一多糖REP4P21(60.9 mg,得率为0.014%)和多糖REP4P22(59.4 mg,得率为0.013%)。REP4P21由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖组成,摩尔比为1.81:11.04:3.35:30.33:27.94:25.53,分子量为117,209 Da;REP4P22由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖组成,摩尔比为9.04:79.26:3.12:5.22:3.37,分子量为55,371 Da。生物活性研究表明,紫丹参中分离的四种酸性多糖ZDS05、ZDS1、ZDS2、ZDS4对胰腺癌细胞SW1990的增殖有一定的抑制作用。紫丹参寡糖Z0P21以及其硫酸化衍生物能够抑制人微血管内皮细胞(HMEC-1)管腔形成。靶向性研究表明Z0P21能够与Galectin-3结合,KD值为5.777×10-6。玫瑰花中分离三种多糖(REP0,REP05,REP4)对胰腺癌细胞SW1990的生长有不同程度抑制作用。其中多糖REP4活性最好,具有浓度梯度依赖性,在1 mg/m L给药72 h后对胰腺癌细胞SW1990的抑制率为48.96%。在REP4多糖中分离得到均一多糖REP4P22在浓度达到1 mg/m L时对As PC-1、PANC-1和SW1990抑制率分别为31.20%、24.20%和29.65%,且该多糖对正常细胞HPDE6-C7的生长无抑制作用。结论:从紫丹参中提取分离出五种多糖组分(ZDS0、ZDS05、ZDS1、ZDS2、ZDS4),纯化得到一个中性寡糖Z0P21,Z0P21是由1个葡萄糖和3个半乳糖组成的直链葡萄半乳四聚糖。从玫瑰花中分离出三种多糖(REP0、REP05、REP4),纯化得到一个均一多糖REP4P21。生物活性结果表示4种紫丹参多糖组分(ZDS05、ZDS1、ZDS2、ZDS4)和3种玫瑰花多糖组分(REP0,REP05,REP4)均有一定抑制胰腺癌细胞生长活性。紫丹参寡糖Z0P21可能通过靶向结合Galectin-3,从而发挥抗血管生成作用;玫瑰花多糖REP4P22,能抑制胰腺癌细胞生长,但对人体正常细胞无毒副作用。上述研究为基于中药紫丹参和玫瑰花活性物质基础的理解及其多糖创新药物研究奠定了一定理论基础。
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