研究背景移植物动脉硬化是各种器官移植物发生慢性移植物失功的共同病理变化。移植物动脉新生内膜增生所致管腔狭窄，引起移植器官的血供不足和纤维化，被认为是移植物功能进行性恶化的首要原因。近来研究发现新生内膜平滑肌细胞是受体起源，95％以上是平滑肌细胞，多种细胞可以参与新生内膜的增生并分化成平滑肌细胞。在不同的模型中显示，骨髓细胞是否参与血管新生内膜增生与中膜平滑肌损伤程度有关，只有在严重损伤的情况下，骨髓细胞才被动员参与血管修复、新生内膜增生。骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，能够参与各种损伤组织的修复。骨髓间充质干细胞在体外能够分化成为平滑肌细胞和内皮细胞，是否参与移植物动脉硬化目前尚不清楚，因此研究间充质干细胞是否参与移植物动脉硬化，诱导中膜平滑肌细胞大量凋亡能否促进间充质干细胞参与移植物动脉硬化，对进一步阐明移植物动脉硬化的发病机制及提供有效的防治策略具有重要的理论意义和应用前景。目的构建稳定表达EGFP的骨髓间充质干细胞，明确骨髓间充质干细胞是否参与移植物动脉硬化，构建组织特异性SM22α启动子驱动P53基因慢病毒载体，诱导血管平滑肌细胞凋亡对骨髓间充质干细胞体外增殖和迁移的影响，体内参与移植物动脉硬化的影响，探讨骨髓间充质干细胞参与移植物动脉的机制。方法采用常规血管环贴壁法、酶消化法，改良血管环贴壁法培养大鼠主动脉内皮细胞，有限稀释法纯化内皮细胞，采用组织块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞。PCR扩增组织特异性的SM22α启动子，构建以此为启动子的慢病毒载体，体外感染大鼠主动脉平滑肌细胞和内皮细胞；原代培养并纯化大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞仪测定细胞表面标志，体外诱导分化进行鉴定，将携带EGFP的慢病毒载体体外感染骨髓间充质干细胞，构建能够稳定表达EGFP的BMMSC-EGFP：建立大鼠主动脉移植模型，将骨髓间充质干细胞从尾静脉输入受体大鼠体内，组织学检查判定移植物动脉硬化，在荧光显微镜下观察移植物中表达EGFP的细胞；构建SM22α启动子驱动的P53慢病毒载体，体外感染平滑肌细胞诱导凋亡，Hoechst 33258染色和Annextin V-FITC/PI染色流式细胞仪测定平滑肌细胞的凋亡，收集并浓缩细胞凋亡上清，CCK-8法测定细胞凋亡上清对间充质干细胞的增殖作用，Transwell小室法测定凋亡上清对间充质干细胞趋化迁移的影响；SM22α启动子驱动的P53慢病毒载体离体感染主动脉移植物，TUNEL测定中膜平滑肌细胞的凋亡，荧光显微镜观察移植物中表达EGFP的细胞。结果改良血管环贴壁法培养大鼠主动脉内皮细胞的效果最佳，并以此采用有限稀释法纯化得到无杂细胞的内皮细胞，组织块法适合动脉平滑肌细胞的原代培养。PCR扩增的SM22α启动子经测序鉴定符合要求，成功构建了以此为启动子的慢病毒载体，体外能够特异驱动报告基因在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达。全骨髓贴壁法得到的大鼠骨髓间充质干细胞经流式细胞仪鉴定表面标志均证实是高纯度骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞在体外能够分化成脂肪、血管平滑肌细胞和成骨细胞，pH稳定的培养基对于骨髓间充质干细胞的长期传代培养是必须的。慢病毒能够高效感染骨髓间充质干细胞，凝聚胺能够提高感染效率，感染后的骨髓间充质干细胞长期稳定表达EGFP。移植物主动脉发生典型的移植物动脉硬化病变，在荧光显微镜下观察到表达EGFP的细胞成多层聚集于新生内膜靠近管腔处；成功构建SM22α启动子驱动的P53慢病毒载体，体外感染动脉平滑肌细胞在凋亡刺激剂存在的条件下能够诱导凋亡，细胞凋亡上清对骨髓间充质干细胞有促进增殖和迁移的作用；P53体内感染移植物动脉诱导了中膜平滑肌细胞的大量凋亡，荧光显微镜下观察到了大量表达EGFP的细胞聚集于新生内膜处。结论骨髓间充质干细胞参与移植物动脉硬化与中膜平滑肌细胞凋亡有关，诱导中膜平滑肌细胞凋亡能促进骨髓间充质干细胞参与移植物动脉硬化，可能与平滑肌细胞凋亡能促进骨髓间充质干细胞的迁移和增殖有关。