hHsp70（人源HspA1A）是人体内应激诱导表达的热休克蛋白70，它作为分子伴侣参与蛋白质的折叠、组装、转运和错误折叠蛋白质的重折叠、降解及应激反应等多种生命活动。多种不同Hsp70上不同位点的半胱氨酸残基分别报道能够发生次磺酸化、亚磺酸化、亚硝基化、谷胱甘肽化等多种翻译后修饰，但其调节Hsp70结构与功能的构效机制并不十分清楚。　　在本研究中，通过在体外不同位点半胱氨酸保留与缺失的组合突变体，系统地研究了hHsp70上五个半胱氨酸残基的反应活性及其发生谷胱甘肽化修饰的能力，结果显示Cys267、Cys306、Cys574、Cys603能够发生原发性谷胱甘肽化修饰，Cys17在Cys267发生修饰后能发生继发性修饰;当hHsp70处于核苷酸结合态时，hHsp70核苷酸结合域(NBD)上的Cys17、Cys267和Cys306显示活性降低、不再被谷胱甘肽化修饰;而hHsp70底物结合结构域(SBD)上半胱氨酸残基Cys574和Cys603的活性及被谷胱甘肽化修饰的能力不受核苷酸及底物多肽结合的影响。我们使用内源荧光、圆二色谱、尺寸排阻色谱、核磁共振等方法表征了谷胱甘肽化修饰对hHsp70结构产生的影响;使用孔雀石绿定磷法及荧光偏振技术分别检测了谷胱甘肽化修饰对hHsp70的ATPase活性与多肽底物结合能力的影响。　　通过对谷胱甘肽化修饰的SBD结构解析发现，谷胱甘肽化修饰导致SBDα螺旋簇去折叠，去折叠后的Leu542与SBDβ的疏水腔相互结合，模拟出一种多肽底物结合自身SBD疏水腔的结构形式。这种作用形式通过结构域通讯，导致hHsp70的ATPase活性的升高;通过直接竞争结合hHsp70底物结合腔，导致hHsp70多肽底物及其他蛋白底物（例如Hsf1，热休克转录因子1）的释放，可能是氧化应激引起体内热休克反应的原因之一。进一步研究显示，点突变、温度及Cys574和Cys603之间形成二硫键等多种条件都能对此SBDα螺旋簇稳定性产生影响，进而影响hHsp70的结构与功能。　　基于对hHsp70上的半胱氨酸残基活性的系统研究，及对hHsp70 SBD构象变化的了解，本研究通过质谱、核磁共振、圆二色谱和内源荧光等多种方式鉴定出PES（Pifithrin-μ）是作用于hHsp70 SBD上Cys574和Cys603的共价抑制剂。该共价修饰不可逆的产生类似谷胱甘肽化修饰的对hHsp70结构与功能的影响:使SBDα螺旋簇去折叠，增加hHsp70 ATPase活性，降低hHsp70底物结合能力。本研究同时显示，核苷酸及多肽底物的结合能够显著抑制PES与hHsp70的共价反应速率。　　综上所述，我们的工作表明hHsp70上5个半胱氨酸残基均有一定的反应活性，特别是位于hHsp70底物结合结构域(SBD)上的Cys574和Cys603，它们的活性不受核苷酸及底物多肽结合的影响，很可能是hHsp70感知胞浆氧化环境变化的传感器，可作为hHsp70共价抑制剂的新靶点;而对其作用机制的探讨，拓展了对Hsp70变构调节的认识，为进一步研究Hsp70工作机理及其抑制剂的开发指出了新的方向。