第一部分根皮苷对db/db小鼠肾脏的保护作用研究背景糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种由于胰岛素抵抗伴有相对胰岛素不足或胰岛素分泌缺陷而导致的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病。是在遗传和环境因素的共同作用下发生的一种慢性代谢性异常。随着社会经济的发展和人民生活水平的提高,生活方式的改变和社会人口老龄化,糖尿病患病率在世界范围内呈上升趋势,已经成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的又一严重危害人类健康的全球公共卫生问题,也成为世界各国致死、致残并造成医疗开支增高的主要原因。糖尿病以慢性血糖水平增高为特征,长期的高血糖可使一些组织或器官发生结构改变和功能障碍,导致多系统损害和各种并发症的产生。诸如心脏、血管、肾脏、神经、视网膜、周围神经、脑等组织器官的慢性进行性病变。在糖尿病各种慢性并发症中,糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是最常见的并发症之一,30-40%的糖尿病患者存在DN (Heerspink and de Zeeuw,2011)。目前DN为我国终末期肾衰的第二大病因。DN的病理生理改变包括肾脏高滤过高灌注等血流动力学改变,肾小球肾小管的肥大,肾小球基底膜的增厚和基质的沉积。逐渐发展成肾小球硬化,肾小管间质纤维化,肾功能逐渐减退(Dronavalli et al.,2008; Wolf et al.,2004; Kanwar et al.,2008)。DN的病理生理机制仍然不是十分清楚,总的来说是复杂的多因素作用的结果,包括遗传易感性,氧化应激,糖基化终末产物的沉积,血流动力学改变等。迄今为止,针对DN防治手段仍然集中于代谢危险因素的控制(如严格控制血糖、血压、血脂),戒烟,血管紧张素转换酶抑制剂的应用等。然而上述治疗方法并不能完全阻断DN的发展。因此有必要寻求新的治疗方法阻止或延缓DN的发生和发展。因此,开发研制新型药物,在积极控制血糖的同时,关注并加强对DN的干预和治疗有着极为重要的意义。根皮苷是一种天然酚类物质,分子式为C21H24O10,可由苹果树的根、皮、茎、嫩叶及果实中提取获得。早在1835年,法国化学家从苹果树皮中提取了根皮苷。研究资料表明,苹果树体内酚类物质总含量中,根皮苷占到95%。根皮苷具有多种潜在的功效,包括降血糖,抗氧化,抗衰老,抗肿瘤等。根皮苷抑制内皮粘附分子和血小板激活,对血管内皮有保护作用。除此之外,根皮苷还具有多种生物学活性,如调节血压,保护心脏及清除体内自由基等。然而,根皮苷对糖尿病肾病是否有保护作用,目前国内外尚未见报道。我们课题组的前期研究发现根皮苷能够减轻db/db鼠的大血管并发症,主要通过其抗糖基化和抗氧化应激的作用(Shen et al.,2012)。虽然有报道根皮苷能够有效降低血糖水平,但是在预防和治疗DN方面的作用还有待研究。本实验以db/db小鼠作为2型糖尿病动物模型,给予根皮苷干预,观察根皮苷对2型糖尿病肾病的影响,讨论可能的作用机制,为临床治疗DN提供新的思路和途径。研究目的1.观察根皮苷对db/db小鼠空腹血糖、甘油三酯、胆固醇、糖基化终末产物、血肌酐、尿素氮、尿酸和24小时尿蛋白等指标的影响,探讨根皮苷对db/db小鼠肾脏保护作用的可能的机制。2.观察db/db小鼠肾脏组织病理学变化和超微结构变化,以及根皮苷对db/db小鼠肾脏损害的影响。研究方法7周龄雄性C57BLKs/J db/m小鼠8只,以及7周龄雄性C57BLKs/J db/db小鼠16只,饮水不限,均给与饲喂颗粒饲料,经过1周观察进入实验。16只db/db小鼠随机分为两组：糖尿病根皮苷干预组(DMT)8只,每日给予根皮苷(20mg/kg/d)生理盐水溶液灌胃；糖尿病组(DM)8只,给予相同体积的生理盐水灌胃；正常对照组(CC)db/m小鼠8只,给予相同体积的生理盐水灌胃10周。实验期间每周定期测量体重(body weight,BW)并记录。于10周末,代谢笼收集三组小鼠24小时尿,测定24h尿蛋白定量。所有小鼠空腹过夜,10%水合氯醛麻醉后(350mg/kg),腹主动脉取血处死。留取血清检测空腹血糖(fasting blood glucose, FBG),甘油三酯(triglyceride, TG)、胆固醇(total cholesterol, TC)、糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(creatinine, Cr)、尿酸(uric acid, UA)。留取的肾组织用4%多聚甲醛固定后,石蜡包埋、切片,HE染色,光学显微镜观察肾组织病理改变,应用透射电镜观察肾组织超微结构变化。部分肾组织分离后迅速存于液氮,-80℃保存,用于蛋白质组学研究。研究结果1.一般观察CC组小鼠生长以及精神状况良好,活跃,毛发光顺。DM组小鼠实验进程中,逐渐表现为污秽无泽,被毛蓬松,少动,明显多饮、多食、多尿,体重快速增加。DMT组小鼠上述表现有所减轻。2.根皮苷对db/db小鼠体重变化影响实验开始时,DM组和DMT组基础体重差异无统计学意义(P>0.05),均明显高于CC组(P<0.05)。自实验第2周开始,DM组小鼠体重逐渐增加,该趋势一直持续至第10周实验结束。然而,DMT组小鼠在实验的第2、4、6、8、10周体重均明低于DM组,差异有统计学意义(P<0.05),表明根皮苷能够显著改善DM小鼠的体重。3.根皮苷对db/db小鼠FBG、TC、TG、AGEs的影响实验开始时DM组与DMT组间的FBG水平无显著性差异(p>0.05),但与CC组比较,两组FBG水平均明显升高(p<0.05)。给予根皮苷干预10周后,DM组小鼠FBG、TC、TG、AGEs均明显高于CC组(p<0.05),DMT组小鼠的FBG、TC、TG、AGEs水平均显著低于DM组(p<0.05)。表明根皮苷显著降低了db/db小鼠的FBG、TC、TG、AGEs的水平。4.根皮苷对db/db小鼠24小时尿蛋白总量、尿酸和肾功能的影响10周后,DM组小鼠表现为持续性尿蛋白增多,与CC组比较有显著性差异(P<0.05)。DMT组尿蛋白排出明显减少,与DM组相比有显著性差异(P<0.05)。DM组小鼠BUN、Cr和UA水平与CC组相比逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05), DMT组治疗后与DM组相比,BUN和Cr显著降低,差异有统计学意义(P<0.05); UA水平轻微下降,差异无统计学意义(p>0.05)。5.根皮苷对db/db小鼠肾脏组织形态学影响CC组系膜细胞及细胞外基质(ECM)无明显增生,毛细血管腔开放良好。DM组肾小球体积增大,系膜细胞增生,细胞外基质增多。DMT组肾小球体积增大及系膜细胞增生情况较DM组明显减轻,细胞外基质增多情况较DM组明显改善。表明根皮苷对db/db小鼠肾脏有保护作用。6.根皮苷对db/db小鼠肾脏超微结构的影响电镜下DM组系膜细胞插入,基底膜(GBM)增厚,足细胞(FP)数量减少,胞质空化,足突细胞形态异常,足突细胞融合。DMT组的GBM厚度及足细胞数量与CC组相比无统计学差异。结论根皮苷能够有效减轻db/db小鼠体重,降低小鼠的FBG、TC、TG、AGEs水平,减少24小时尿蛋白量,降低BUN、Cr,减轻肾脏病理损害。根皮苷对db/db小鼠肾脏的保护作用与其降糖、调脂、降低AGEs水平,抗氧化作用有关。有望作为一种新型的药物为2型糖尿病肾病的防治提供新的思路和手段。第二部分根皮苷保护db/db小鼠肾脏作用机制的蛋白质组学研究研究背景随着人类基因组工作框架的完成,生命科学的研究进入了后基因组时代。基因只是遗传信息的载体,而蛋白质才是主要的生命活动载体和功能执行者。因此对蛋白质组学研究也逐渐成为后基因组研究中的核心内容。蛋白质组学最大的应用前景是在药物研发领域。对细胞、组织、体液中蛋白质的研究在药物研发中有重要作用。蛋白质组学不但能证实已有的药物靶点进一步阐明药物作用的机制,并能发现新的药物作用位点,还可用来分析分子信号传导过程的应答和调节。精确鉴定及定量整个细胞基因组所表达的全部蛋白质称为定量蛋白质组学。定量蛋白质组学的重点是定性定量地分析整个细胞内所有蛋白质的动态变化,从而反映细胞功能、过程、机制等综合信息。它是功能蛋白质组学的重要内容。随着蛋白质组学技术的发展,一种基于质谱的蛋白质组定量分析技术即同位素标记的相对和绝对定量技术(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)以其独特的优越性,正逐渐成为定量研究中的主要方法之一。iTRAQ是2004年美国应用生物系统公司推出的一种利用同位素标记技术,可以对相同实验条件下4个样本进行定量研究,作为一种新的蛋白质定量技术,相对于其它定量蛋白质组学方法有无可比拟的优点,可以对样本中的几乎所有蛋白进行标记,因此可以对磷酸化蛋白,糖基化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定量定性研究,从中可以获得更为详尽的样品信息。标记过程更简单,在室温条件下1小时即可完成,质谱检测更为灵敏。因此iTRAQ技术可以为多个不同时间段的样品分析、膜蛋白研究、疾病标志物的发现与鉴定提供定量信息,并可为感兴趣的目标蛋白进行绝对定量。其已经在探讨疾病发生机制、疾病标志物的寻找和不同时段或者不同状态的多样本定量分析等蛋白质组学研究领域得到了很好的应用。本研究第一部分实验发现根皮苷对于db/db小鼠肾脏具有明显的保护作用。但是迄今为止,根皮苷是通过何种机制发挥对2型糖尿病肾脏损伤的的保护作用尚不清楚。为了进一步探讨根皮苷对2型糖尿病肾脏损伤的保护作用及其作用靶点,本研究采用国际上公认的2型糖尿病(T2DM)模型小鼠——db/db小鼠为研究对象,对正常对照组(CC组),db/db小鼠组(DM组)与db/db小鼠根皮苷治疗组(DMT组)肾脏应用iTRAQ蛋白质组学分析,寻找差异表达蛋白,旨在揭示根皮苷对于db/db小鼠肾脏损伤的保护机制,为临床糖尿病肾病的治疗寻求更为有效的药物提供候选靶点。研究目的1.应用iTRAQ技术结合质谱分析,研究db/db小鼠肾脏组织的全部蛋白质的差异表达情况,了解2型糖尿病肾脏损伤的蛋白质组学改变。2.研究db/db小鼠经根皮苷治疗后肾脏组织的差异蛋白表达,筛选药物治疗靶点,分析分子信号传播过程的应答和调节,进一步揭示根皮苷对于糖尿病肾脏的保护机制。研究方法选取CC组、DM组与DMT组三组小鼠各4只,处死动物,分离肾脏组织。根据iTRAQ蛋白质组学技术要求的样本制备标准技术流程,对肾脏组织进行预处理。经过对肾组织切碎、研磨、超声破碎、蛋白酶裂解等过程提取肾脏组织的总蛋白,应用Bradford蛋白质定量法测定蛋白质浓度,将样品保存于-80℃备用。提取肾脏总蛋白后,各组上样20ug样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察各组之间电泳后蛋白点迁移平行度。各组肾脏总蛋白采用FASP酶解得到相应肽段。各组取60ug肽段,按照ABI公司说明书操作与标记酶解后的各组肽段,依次分别为114标记CC组,116标记DMT组,115则标记DM组。标记结束后利用ABI4800MALDI-TOF/TOF质谱仪各组均随机选取一定数量肽段,并检测其二级质谱图中低分子量端是否存在相应质量标记试剂,确定标记成功。将三组标记的肽段混合后用Agilent HPLC1200强阳离子交换柱(strong cation exchange, SCX)进行分离分级,然后用C18Cartridge (Sigma)脱盐,不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。进行下一步液相质谱-串联质谱分析(LC-ESI-MS/MS),应用Thermo Finnigan LTQ Velos质谱仪进行。质谱仪在线配备0.15mm*150mm C-18反相色谱柱(RP-C18Column Technology Inc),液相A液为0.1%甲酸水溶液,B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%),采用微毛细管上样,温度为200度,检测方式为正离子,扫描后收集5个碎片图谱来获得多肽碎片的质/荷比(m/z比)。原始文件(raw file)用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量数据,并用SEQUEST软件鉴定多肽分子。最后,使用Identified iTRAQ Statistic Builder软件将定量及鉴定结果进行合并处理,得到定量和鉴定结果。采用软件计算的ratio_biweight值作为蛋白质定量结果,以114标记为内参。搜索使用的数据库为IPI mouse (international protein index, version3.72)蛋白数据库。应用EXPASY蛋白质组学工具分析等电点、分子量等。采用GO分类工具(http://www. geneontology.org, VERSION1.8)和KOGnitor (eukaryotic orthologous groups)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/grace/kognitor.html)分析对经鉴定的肾脏蛋白质表达谱进行定位分类与功能分析。应用Ingenuity Pathways Analysis(IPA)软件进行生物信息学分析。研究结果1. db/db小鼠肾脏组织总蛋白SDS-PAGE结果电泳结果显示3组肾组织SDS-PAGE蛋白质点迁移条带清晰,各组间平行度较好,可以进行下一步实验。2. iTRAQ标记统计学验证对照组是114标记的正常对照组小鼠肾脏组织的蛋白样品,115标记的db/db组小鼠和116标记的根皮苷治疗组小鼠肾组织蛋白样品分别与对照组的比值进行统计分析。结果显示蛋白标记实验均一性好,10%的蛋白差异有显著性,符合统计学的规律。3.质谱数据解析结果本研究中,以114标记的正常组小鼠肾组织蛋白样品做为对照,将115标记的糖尿病组小鼠和116标记的根皮苷治疗组小鼠肾脏蛋白样品与对照的比值进行统计分析。比值大于1.5或小于0.67的蛋白即为根皮苷治疗后表达明显上调或者下调的肾脏组织蛋白。应用iTRAQ联合LC-MS/MS,我们分析了db/db小鼠根皮苷干预后肾脏蛋白质组学的变化情况。本研究经质谱鉴定得到的唯一肽段14894条,2842种蛋白质,其中有定量信息的蛋白有2820种。经质谱鉴定糖尿病小鼠经根皮苷治疗后肾脏组织有121个差异表达蛋白的表达水平恢复。其中表达上调的蛋白42个,经根皮苷治疗后这42个蛋白的表达都出现了回调；表达下调的蛋白79个,经根皮苷治疗后这79个蛋白的表达都出现了回调。4.根皮苷干预后肾组织差异蛋白质的定位分析应用UniProt蛋白数据库(http://www.uniprot.org)的GO分析以及相关文献,对质谱鉴定出的121个差异蛋白点分析进行定位分类。5.根皮苷干预后肾组织差异蛋白质的IPA分析应用IPA软件将差异表达蛋白进行PATHWAY分析,分别绘制出了经质谱鉴定的某些差异表达蛋白在肾脏疾病相关的病理生理过程中的参与位点,这些代谢通路包括了脂质代谢、自由基清除和分子转运等。这些通路有利于更好的理解糖尿病肾脏损害的分子机制及根皮苷的干预靶点。结论1.作为定量蛋白质组学的新技术iTRAQ具有高灵敏性、高通量的特点,可以对多组样本同时进行比较,可以获得更好的蛋白质组覆盖率和可靠的各组差异表达蛋白。因此,iTRAQ可用于研究根皮苷对db/db小鼠肾脏保护作用的分子机制,寻找药物靶点。为进一步阐明根皮苷治疗糖尿病肾病的作用机制提供了新的思路和方法。2.应用LC-ESI-MS/MS鉴定DM组和CC组小鼠肾脏差异表达蛋白2842个,经根皮苷治疗后回调的蛋白121个。其中表达上调的蛋白中有42个经根皮苷治疗后表达都出现了回调；表达下调的蛋白中有79个经根皮苷治疗后表达都出现了回调。这些蛋白质的功能涉及脂质代谢、自由基清除和分子转运,提示这些过程参与了2型糖尿病肾病的发生发展。