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目的:从传统的中草药中寻找新的抗癌药物,运用现代分子生物学手段对其药理学作用进行新的探索和诠释,已成为当前中草药研究的趋势。苦参碱是从我国传统中药苦参中提取出的一种生物碱活性成分,具有广泛的药理学作用。我们多年来的研究证明,苦参碱在体外可明显抑制人白血病细胞K562的增殖,诱导其向正常形态分化并显著影响细胞周期和端粒酶活性。这些表型的改变是基因差异表达的结果。运用基因表达谱芯片,我们发现了多个相关的差异表达基因,包括功能已知的和功能未明的。CGI-100是功能未明的基因之一,本课题旨在了解CGI-100基因与苦参碱诱导K562细胞分化和凋亡的关系,为研究肿瘤发生和逆转开辟新的途径;为寻找肿瘤治疗新靶点、探索苦参碱抗肿瘤作用、开发肿瘤治疗新药物提供实验基础。方法:1.利用RT-PCR半定量检测苦参碱作用K562细胞前后CGI-100基因的表达情况。2.从K562细胞中提取总RNA,RT-PCR反应扩增得到CGI-100基因CDS片断,A-T克隆至pMD18-T载体,经测序鉴定后定向亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建得到pIRES2-EGFP/ CGI-100重组质粒。3.将pIRES2-EGFP/ CGI-100重组质粒转染K562细胞,G418稳定筛选4w后,有限稀释法筛选得到单个克隆K562阳性细胞株,将其命名为K562-CGI-100细胞,以此重组的K562细胞进行后续实验。4.以K562- CGI-100细胞为实验对象,RT-PCR检测目的基因的表达状况,电镜观察细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:1. 0.1～1.0mg/ml苦参碱处理K562细胞后,CGI-100基因表达呈剂量依赖性下降; 0.1mg/ml苦参碱处理K562细胞3h内CGI-100mRNA表达迅速降低,与对照有显著性差异(p<0.05),3h～48h内保持相同的低表达水平。2.成功构建带有EGFP筛选标记的CGI-100基因真核表达载体pIRES2-EGFP/ CGI-100,经双酶切和质粒测序鉴定,该重组质粒序列正确,基因插入方向正确。3.将上述构建的真核表达质粒转染K562细胞,经G418抗性筛选和有限稀释筛选出单个阳性细胞克隆,荧光倒置显微镜下观察到细胞内绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR鉴定有CGI-100 mRNA的过量表达。该重组K562细胞阳性单个克隆在体外稳定传代扩增后作为后续的实验对象。4.K562细胞中CGI-100基因的过表达后,细胞常染色质增加,异染色质减少,细胞增殖旺盛,细胞周期中s期细胞增多。结论:1.不同浓度的苦参碱诱导K562细胞分化和凋亡的过程中CGI-100表达量出现降低,我们认为苦参碱能抑制CGI-100基因的表达,同时提示该基因可能参与苦参碱作用K562细胞的早期反应。2.构建并鉴定了含CGI-100基因CDS片断的真核表达质粒。3. CGI-100基因的过表达能使K562细胞增殖加速、幼稚程度增加。