神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)来源于交感神经系统,是一种常见的小儿颅外实体外周神经系统恶性肿瘤,占儿童肿瘤发生率的8%~10%以及儿童癌症死亡的15%。神经母细胞瘤从良性神经元到形成肿瘤的过程都具有异质性,其较强的增殖和转移能力是导致患者死亡的主要因素。其中,60%患儿初步诊断时年龄大于1岁,45%患儿在发现时已经有远处转移。神经母细胞瘤的临床表现各不相同,在晚期的病人中通常会发现其对包括手术、化疗和放疗等传统的治疗方法具有很强的抗性。因此,近年来大量的实验致力于探索针对神经母细胞瘤的新的治疗手段。SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)是近几年新发现的一种组蛋白甲基转移酶。研究表明,SMYD3在肝癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌等癌症组织或细胞中高表达,而在相应正常组织中低表达甚至检测不到,这说明SMYD3与肿瘤的发生和发展有紧密的联系。本研究通过探究SMYD3对神经母细胞瘤细胞的增殖和成瘤作用,以期能为神经母细胞瘤的治疗提供新的思路。本文首次揭示SMYD3对神经母细胞瘤的增殖和凋亡过程的重要作用,基于肿瘤临床预后数据库的分析发现,SMYD3可以显著影响神经母细胞瘤患者的预后状况,同时检测了SMYD3在不同神经母细胞瘤细胞系中的表达水平。通过在神经母细胞瘤细胞系BE(2)-C和SHEP1中进行SMYD3敲低和恢复表达实验,检测其对细胞的生长增殖以及周期和凋亡的影响,探索其对细胞增殖的调控作用。实验的主要的结果如下:1.组蛋白甲基化转移酶SMYD3对神经母细胞瘤患者的预后影响及其表达分析通过分析神经母细胞瘤的预后数据库Versteeg,发现SMYD3高水平表达的患者的生存率明显低于低表达的患者,且SMYD3的表达水平与肿瘤患者的肿瘤等级、患病年龄等显著相关,这表明SMYD3可能与神经母细胞瘤的恶性程度有一定关系。通过荧光定量PCR和Western blot实验检测SMYD3在神经母细胞瘤细胞系中的表达水平,结果表明SMYD3在神经母细胞瘤中普遍表达,并且与肿瘤的恶性程度相关。2.SMYD3促进神经母细胞瘤生长为了探究SMYD3促进神经母细胞瘤恶性增殖的机理,我们用慢病毒包装SMYD3的干涉和过表达载体后感染人神经母细胞瘤细胞系,用嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系,从而检测SMYD3表达水平改变对神经母细胞瘤生长的影响。细胞增殖曲线和BrdU标记实验显示,干涉SMYD3明显抑制了细胞的体外增殖能力。通过流式细胞术分析细胞周期分布发现,SMYD3干涉的BE(2)C和SHEP1细胞的S期比例明显减少,而过表达SMYD3细胞的S期比例增加。Western blot检测发现,干涉SMYD3表达后,G1/S期周期蛋白CDK2和cyclinE的表达明显受到抑制。通过建立小鼠皮下成瘤动物模型,发现干涉SMYD3后细胞的成瘤能力降低,而过表达恢复后细胞的成瘤能力得到了一定程度的提升。软琼脂克隆形成实验得出,SMYD3干涉的BE(2)C和SHEP1细胞形成的克隆不仅数量减少,而且体积缩小。这些结果表明,SMYD3能够促进神经母细胞瘤的生长,所以针对SMYD3的靶向治疗有望起到干扰神经母细胞瘤进一步发展的作用。3.SMYD3通过抑制P53/P21途径来促进神经母细胞瘤生长通过查阅文献发现,在胃癌细胞中SMYD3可能通过抑制p53的蛋白水平来促进细胞的增殖,故采用Western blot检测SMYD3干涉对p53和p21的蛋白水平影响,并进行SMYD3表达恢复实验。在BE(2)C和SHEP1细胞系中干涉SMYD3表达引起p53和p21水平升高,而在SMYD3干涉的细胞感染过表达SMYD3的慢病毒时,SMYD3含量有一定程度的恢复,原先升高的p53/p21水平有所降低。Real-time RT-PCR和Western blot检测发现,当干涉SMYD3表达时,p53的经典泛素化蛋白MDM2未变化,而泛素化蛋白酶TRIM24表达水平下调;恢复表达SMYD3后,TRIM24表达随之上调,而MDM2未变化。这些结果说明,SMYD3对p53的调控是通过TRIM24来介导的,而不是MDM2;SMYD3对神经母细胞瘤生长的促进作用可能是由TRIIM24介导的p53/p21信号通路所介导。综上所述,SMYD3对神经母细胞瘤细胞的生长增殖以及成瘤具有重要作用,本研究结果为SMYD3作为肿瘤的标记物提供了重要依据,也丰富了神经母细胞瘤分子治疗的理论基础。