论文部分内容阅读
H9N2亚型禽流感在全球分布范围广,同时也是在我国禽群中流行最为广泛的流感病毒亚型。H9N2亚型禽流感病毒自1966年于北美火鸡中首次分离以来,不但给养禽业造成了巨大的经济损失,而且可以跨宿主传播感染哺乳动物和人,对公共安全构成严重威胁。作为流感病毒的主要表面囊膜蛋白之一的血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白,不仅在病毒与宿主细胞的唾液酸（sialic acid,SA）受体结合中起到关键作用,还是流感病毒的主要抗原蛋白,能够刺激机体产生中和抗体。本文通过对NCBI与GISAID数据库中H9N2亚型禽流感病毒序列分析发现,我国流行的H9N2禽流感病毒主要是G57基因型。我们对G57基因型病毒HA基因全长序列（n=5,271）的糖基化模式进行了分析,发现其HA基因序列的糖基化模式呈现多态性:2007年分离的首株病毒有7个N-连接糖基化基序（N-linked glycosylation sequon,NGS）,而2010年以后又陆续出现了含有6～3个NGS的糖基化模式。值得关注的是,不同HA糖基化模式病毒的流行能力存在明显差异。在这5种糖基化模式中,含有6个NGS的病毒的流行优势一直保持至今,是G57基因型病毒中具有绝对流行优势的糖基化表型。研究H9N2亚型禽流感病毒HA基因随进化不断累积的氨基酸位点变异及其对病毒增殖能力、受体亲和性、抗原性的影响,对进一步揭示病毒的适应性进化与疫苗设计有重要意义。为了研究H9N2亚型禽流感病毒血凝素糖基化模式的生物学效应,本研究利用基因定点突变和反向遗传操作技术拯救了5株具有不同HA糖基化模式的病毒,分别命名为reHA3、reHA4、reHA5、reHA6、reHA7。5株病毒在CEF细胞上的生长动力学曲线显示,在感染后2～10h,reHA6滴度极显著高于其余4株病毒（p＜0.01）;在感染后48h时,reHA7滴度显著高于reHA6（p＜0.05）,而在感染后72h时,各病毒滴度无显著差异（p＞0.05）。p H稳定性试验结果表明,reHA5、reHA6、reHA7在不同p H条件下的稳定较好,而reHA3和reHA4耐酸性较差;热稳定性试验结果显示,reHA6在56℃和50℃条件下能够长时间地保持血凝活性,而其余4株病毒的血凝活性保持时间较短。综合评价显示,reHA6的热稳定性与酸稳定性最好,reHA7、reHA5次之,而reHA4、reHA3最弱。红细胞洗脱试验结果显示,reHA7从红细胞表面解离最慢,reHA6、reHA5次之,而reHA4、reHA3解离最快。用不同浓度RDE处理的红细胞的凝集试验结果显示,reHA7保持完全血凝活性的RDE的使用浓度最高,reHA6次之,reHA3最低。固相结合试验结果显示,5株病毒均可与人型与禽型受体结合,表明其具有双受体结合特性。并且,reHA7与两种受体的亲和性最强,reHA6、reHA5次之,而reHA3最弱。交叉血凝抑制试验结果显示,reHA3、reHA4与reHA7、reHA5、reHA6之间的抗原差异在逐渐增大,reHA5与reHA6、reHA7在逐渐增大。上述结果表明,血凝素糖基化模式影响H9N2亚型禽流感病毒的稳定性、增殖能力、受体亲和性和抗原性,并以210位、305位糖基化位点的效应最为显著。该研究结果为我们深入理解H9N2亚型禽流感病毒的适应性进化提供了新的见解。