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目的:细菌耐药导致全球每年至少70万例死亡,已经成为十分严峻的世界卫生公共问题。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是医院和社区感染的主要原因。持留菌是导致疾病反复发作,慢性感染,是治疗失败的罪魁祸首。耐药菌和持留菌的出现使得传统的抗生素无法发挥继续疗效,是治疗金黄色葡萄球菌感染的两大难题。持留菌被认为是细菌发展成耐药的储药库,目前临床上没有针对持留菌的有效药物,因此研究新型抗持留菌药物对于克服抗生素耐药具有重要意义。本课题组前期研究发现木豆素衍生物具有良好的抗菌活性和清除持留菌的活性,本论文主要是通过对本课题组设计合成的新型木豆素衍生物进行筛选,以期发现有效的抗持留菌化合物,并对活性化合物进行机制探究,以及在小鼠体内评价抗持留菌活性,最终获得安全、有效的新型抗持留菌的先导化合物。方法:1、化合物初筛采用倍半稀释法检测木豆素衍生物对12株革兰氏阳性菌(1株金黄色葡萄球菌和11株MRSA)和3株革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度(MIC);采用MTT法检测化合物对哺乳动物(小鼠巨噬细胞RAW264.7)和正常人肝细胞(LO2)活力的影响;选择MRSA ATCC43300菌株,评价木豆素衍生物抗MRSA持留菌活性,结合MIC和MTT活性数据选择活性化合物,用于进一步的机制研究。2、作用机制研究本课题所筛选的化合物设计是针对细菌的细胞膜。为了验证我们的猜想,本课题设计了膜的渗透性实验,去极化实验和激光共聚焦实验(Confocal)验证活性化合物对细菌细胞膜完整性的破坏作用。通过透射电镜对化合物作用后进行形态学观察。利用260 nm处吸收和试剂盒,从核酸泄漏和ATP泄漏的角度验证细菌细胞膜的破损作用。3.抗MRSA活性评价\通过棋盘法进一步评估活性化合物联用抗生素对MRSA敏感性的影响。利用清除MRSA成熟生物膜实验,评估了活性化合物破坏MRSA形成的粘附生物膜的能力。最后设计小鼠皮肤脓肿模型,接种MRSA持留菌,评价活性化合物体内降低小鼠MRSA持留菌的能力。结果:1、化合物初筛结果37个木豆素衍生物对12种革兰氏阳性菌均有良好的抑菌活性,优于母核木豆素,对三种革兰氏阴性菌均没有效果。MTT细胞毒性评价发现48.64%以上的化合物对两株细胞株均显示有明显毒性,其中,Y7、Y8两个化合物均显示无毒性。抗持留菌初筛实验发现37个木豆素衍生物中有23个化合物作用12个小时对MRSA持留菌有清除作用,证明木豆素衍生物对MRSA持留菌有很好的清除作用。结合MIC和MTT数据,我们选择Y8作为活性化合物,做持留菌杀菌曲线,发现Y8与DMSO相比,4倍、6倍MIC在4小时内可以清除持留菌,2倍MIC在8小时可以清除持留菌。2、作用机制研究膜的渗透性实验、去极化实验和激光共聚焦实验,均证明活性化合物Y8对膜有破损作用,且呈现时间浓度依赖性。TEM实验从形态学上验证了活性化合物Y8对膜的破损作用。核酸泄漏实验和ATP泄漏结果均证明活性化合物Y8破坏细菌细胞膜造成内容物的泄漏,进一步验证了活性化合物Y8对膜的破损作用。通过以上实验证明Y8是作用于细菌的细胞膜,细菌失去完整的膜结构后,失去生理功能,细菌内容物泄漏,从而杀灭细菌。3、抗MRSA活性评价结果a.联合用药结果表明Y8联合帕拉西林表现出协同效应,与庆大霉素、卡那霉素表现出部分协同作用。b.清除生物膜实验证明Y8具有良好的清除MRSA生物膜的活性且呈现浓度依赖性,效果明显优于阳性对照万古霉素,证明活性化合物Y8不仅仅对浮游的细菌有效,也可以清除粘附成熟的生物膜。c.小鼠脓肿模型实验结果:与生理盐水组相比,加药组脓肿组织负菌量减少1～2CFU/g,证明Y8可以降低小鼠体内MRSA持留细菌负荷量。心肝脾肺肾病理切片显示无明显的毒性。结论:本课题从两个系列木豆素衍生物中筛选发现大部分木豆素衍生物对持留菌有清除效果,其中Y8具有较好的抑菌活性和较小的细胞毒性。对Y8进行机制研究发现Y8通过破坏细菌细胞膜从而达到抗菌效果。再进一步进行MRSA活性评价,联合用药显示Y8具有抗生素协同效果,可以破坏MRSA形成的成熟生物膜,并且在小鼠皮肤脓肿模型中表现出较好的降低MRSA持留菌的活性。本研究表明Y8这类作用于细菌细胞膜的抗菌剂,可以作为抗持留菌慢性感染的先导化合物。