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第一部分miR-3619-5p对膀胱肿瘤细胞增殖和转移的抑制作用目的:探讨miR-3619-5p对膀胱癌细胞系T24和5637的细胞增殖、细胞衰老、细胞凋亡、细胞周期、集落形成及侵袭和迁移的影响。方法:应用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测膀胱癌组织及膀胱癌细胞系(EJ、T24、5637和J82)中miR-3619-5p的表达情况。采用脂质体转染方式(终浓度为50n M)将阴性对照ds Control和anti-Control以及miR-3619-5p和anti-miR-3619-5p模拟物转染到膀胱癌细胞系5637和T24细胞中。在转染后72小时收集细胞并使用MTS(Cell Titer 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)检测试剂盒测定转染后24小时,48小时,72小时和96小时4个时间点膀胱癌细胞增殖情况。结晶紫染色用以检测转染后膀胱肿瘤细胞集落形成能力的变化。Ed U和DAPI染色后通过荧光显微镜观察转染后各组细胞增殖能力的变化。用β-半乳糖苷酶染色后观察转染后各组T24和5637细胞衰老情况;采用流式细胞术检测转染后各组T24和5637细胞周期分布变化和凋亡情况;构建裸鼠皮下膀胱癌异种移植瘤模型观察转染后各组膀胱癌细胞在体内增殖能力的变化。划痕实验检测转染后各组膀胱癌细胞T24和5637的迁移情况。采用Transwell小室方法测定膀胱肿瘤细胞在转染后的侵袭和迁移能力。结果:在膀胱癌组织和癌细胞中,miR-3619-5p的表达明显比癌旁组织及正常膀胱粘膜上皮细胞SV-HUC-1表达降低。在膀胱癌T24和5637细胞中,MTS结果显示,与空白对照组Mock和阴性对照组ds Control转染组相比,miR-3619-5p模拟物转染组膀胱肿瘤细胞T24和5637在观察后48小时表现出明显的生长抑制(P<0.05)。克隆实验表明,相比Mock和ds Control组,miR-3619-5p模拟物转染组细胞集落形成的数量显著减少,集落形成的面积明显减小(P<0.05)。Ed U实验结果显示与ds Control转染组相比,miR-3619-5p能明显抑制膀胱肿瘤细胞的增殖。相比阴性对照组ds Control转染组,转染miR-3619-5p模拟物后72小时能够诱导膀胱癌细胞的周期循环G0/G1期的停滞;统计分析显示,与ds Control组相比,两种细胞在转染miR-3619-5p模拟物后,细胞G0/G1期比例升高,S期和G2/M期细胞比例降低(P<0.05)。而且在转染后72小时,miR-3619-5p模拟物转染组中处于早期和晚期凋亡的细胞数明显多于ds Control组,差异有统计学意义(P<0.05)。另外,β-半乳糖苷酶染色后发现,与对照组相比,miR-3619-5p模拟物转染组明显的诱导了T24和5637细胞的衰老。划痕实验及Transwell实验证实miR-3619-5p模拟物转染组较ds Control组能抑制T24和5637细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。在T24和5637细胞分别转染anti-Control模拟物和anti-miR-3619-5p模拟物后发现,敲减细胞内源性miR-3619-5p后能够促进膀胱癌5637和T24细胞的增殖和集落形成,抑制膀胱癌细胞的凋亡,并且促进膀胱癌细胞的侵袭和迁移。结论:miR-3619-5p在膀胱癌组织和癌细胞中呈现低表达状态,可能在膀胱癌中表现为抑癌性。过表达膀胱癌细胞系5637和T24细胞中的miR-3619-5p能够抑制癌细胞的增殖和集落形成能力,对肿瘤细胞的凋亡和衰老有明显的促进作用,并且诱导肿瘤细胞周期循环停滞在G0/G1期。此外,消除膀胱肿瘤细胞内源性miR-3619-5p后能够加速细胞增殖、迁移和侵袭,反向证明miR-3619-5p在抑制膀胱肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭中起着关键作用。第二部分miR-3619-5p抑制膀胱肿瘤的机制研究目的:有研究发现miR-3619-5p在前列腺癌细胞中能够与p21启动子结合,从而抑制前列腺癌细胞的增殖。那么,在膀胱肿瘤细胞中miR-3619-5p能否与p21基因启动子结合抑制膀胱癌细胞?通过软件分析发现miR-3619-5p能够与β-catenin和CDK2基因的3’UTR特定序列结合,那么β-catenin和CDK2在miR-3619-5p抑制膀胱肿瘤中扮演什么样的角色呢?方法:收集15对膀胱癌组织和癌旁膀胱粘膜组织,q RT-PCR检测组织中p21基因m RNA的表达情况;采用免疫组化染色技术检测组织中β-catenin、CDK2和p21基因蛋白的表达情况。Western blot分别检测膀胱癌组织和癌旁膀胱粘膜组织中β-catenin、CDK2和p21蛋白表达水平。同样,采用q RT-PCR和Western blot检测膀胱癌细胞中p21、β-catenin和CDK2 m RNA以及蛋白质的表达水平。生物合成的阴性对照ds Control,miR-3619-5p模拟物,通过脂质体转染方式,将其转入膀胱癌细胞系T24和5637细胞中,转染后72小时,应用q RT-PCR和Western blot分别检测p21及其下游基因m RNA和蛋白质、β-catenin和CDK2蛋白质,以及EMT相关基因的m RNA和蛋白质的表达水平结果:在膀胱癌组织中,p21基因的m RNA和蛋白质表达水平相比癌旁组织中明显降低,膀胱癌组织中β-catenin和CDK2蛋白质表达水平明显高于癌旁组织中。在膀胱癌细胞系(EJ、T24、5637和J82)中p21基因的m RNA和蛋白质表达水平明显低于膀胱粘膜上皮细胞SV-HUC-1;膀胱癌细胞中β-catenin和CDK2蛋白质表达水平明显高于膀胱粘膜上皮细胞中。在膀胱癌细胞5637和T24中,与ds Control转染组相比,转染miR-3619-5p模拟物后72小时能显著激活p21基因及其下游基因的m RNA和蛋白质的表达,而且明显抑制细胞β-catenin和CDK2蛋白质的表达;另外,转染miR-3619-5p使得5637和T24细胞核中β-catenin表达明显减少。结果还显示,miR-3619-5p过表达能引起肿瘤细胞中EMT相关基因的上皮标志物表达的上调和间充质标志物表达的下调。Ch IP实验证实在膀胱癌细胞5637和T24中miR-3619-5p主要通过与p21启动子特定序列靶向结合而激活p21基因表达。双荧光素酶报告基因实验显示在5637和T24细胞中miR-3619-5p与β-catenin和CDK2 3’UTR特定序列直接靶向结合。结论:miR-3619-5p能通过与5637和T24细胞中p21基因启动子特定序列靶向结合从而激活其表达;而且,在激活p21基因的同时,也诱导了其下游基因表达的改变,共同作用于肿瘤细胞的增殖和转移。miR-3619-5p能够与β-catenin和CDK2 3’UTR特定序列靶向结合从而抑制其在肿瘤细胞中的表达;更重要的是,miR-3619-5p抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,并且抑制肿瘤细胞的上皮间质性转化过程,从而对膀胱癌细胞的发生发展产生重大抑制作用。