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本文以转基因白桦亲本及其F1代为实验材料,通过GUS基因表达的组织化学检测结合多重PCR的方法对外源基因遗传稳定性进行检测,同时利用实时定量RT-PCR技术对外源基因bgt的表达情况进行了研究。选取外源基因表达水平不同的F1植株,分析其甲基化位点的遗传变异情况,进一步探究转基因沉默机制。分别应用旁侧序列克隆技术和RACE技术克隆了白桦甲基转移酶基因MET基因、CMT基因和DRM基因。对甲基转移酶基因进行了生物信息学分析,并研究了甲基转移酶基因在转基因白桦亲子代及沉默植株中的表达差异及与转基因沉默的关系。主要结果如下:1、对129株不同杂交组合F1代转基因植株的研究表明,外源基因在遗传传递过程中出现基因分离且部分转基因F1代出现外源基因沉默现象。对外源bgt基因进行定量表达发现,不同组合的杂交子代中外源bgt基因表达差异显著,大部分杂交子代中的表达水平都高于亲本,尤其是反交子代(非转基植株因为母本、转基因植株为父本的杂交子代)的超亲表达现象比较明显。GUS检测阴性多重PCR阳性结果的转基因白桦植株中,bgt基因表现出不表达或低表达现象。2、对转基因白桦亲子代的外源基因DNA甲基化水平的分析结果表明,外源基因正常表达的植株其bgt基因和gus基因的启动子远端区域的甲基化率都比较低,在0～14.29%之间。而F1代中基因沉默的植株其bgt基因和gus基因启动子区和编码区都出现高度甲基化。其它正常表达的F1植株与其亲本的甲基化水平基本一致,并且甲基化的位点也高度相似。3、通过简并引物扩增结合RACE的方法克隆分离到了白桦的BpDRM(Domains rearranged methyltransferase,域重排甲基转移酶)和BpCMT(Chromomethylase,染色质域甲基转移酶)的基因cDNA全长序列。BpDRM基因编码区序列长度为1760bp,编码585个氨基酸,与毛果杨的同源性最高为89%。该序列存在2个AdoMet_Mtases超家族的保守序列,并含有多个底物结合位点、DNA结合位点以及辅因子结合位点,同时1370～1720bp的区域为DNA 5’胞嘧啶甲基转移酶主要发挥功能的区域。BpCMT基因编码区全长为2928bp,编码976个氨基酸,与黄瓜的氨基酸同源性最高达到77%,其次是与毛果杨的氨基酸同源性达到73%。在BpCMT基因序列中预测到多个组蛋白结合位点、9个DNA结合位点、6个底物结合位点以及1个辅因子结合位点。同时还发现了 4段保守基序和3段超家族保守序列。4、采用染色体步移方法从白桦基因组中分离得到BpMET基因全序列。并通过blastx获得了BpMET基因编码区的信息根据编码区保守序列设计引物扩增出BpMET基因cDNA片段全长。BpMET基因全序列的获得共经过了 1步3’下游的步移以及4步5’上游的步移。得到片段大小依次为1584bp、1366bp、1192bp、1691bp和1132bp,重叠区域分别为71 bp、42 bp、93 bp、82 bp和94 bp,拼接后全片段为7424bp。获得白桦BpMET基因cDNA编码区全长序列为4716bp,编码1571个氨基酸,与葡萄氨基酸同源性达到86%。在BpMET基因序列中预测到6个保守基序,3个超家族的保守序列以及5个DNA结合位点、4个辅因子结合位点和4个底物结合位点。通过BpMET基因序列与cDNA序列比对发现11个内含子,其中8个内含子具有典型的GT-AG的内含子结构特征。从构建甲基转移酶基因的进化树来看,MET基因、DRM基因和CMT基因各自聚为一类。从白桦中分离的甲基转移酶基因与毛果杨和苹果的甲基转移酶基因亲缘关系更近,且MET基因与CMT基因的遗传距离比DRM基因更近。5、对甲基转移酶的三个基因编码的蛋白进行生物信息学分析发现,CMT、DRM和MET均为亲水性蛋白,DRM为稳定蛋白、CMT和MET为非稳定类蛋白。对其二级结构分析发现均由α螺旋、延伸链和无规则卷曲结构组成,但三个组成成分所占比例不同且大部分为无规则卷曲结构。MET存在1个跨膜结构域,DRM和CMT存在2个跨膜结构域。6、对于甲基转移酶基因的表达分析发现,子代总体的甲基转移酶表达量略低于亲本,但这种表达量在正反杂交子代中存在差异。而植物自身甲基转移酶基因表达量高导致其自身基因组甲基化水平的偏高从而降低外源基因的表达,甚至引起沉默。