犬瘟热(canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一种具有高度传染性和急性发热的传染病,临床主要以呼吸道、胃肠道和神经系统症状为主。犬瘟热病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属成员,感染宿主广泛,传播方式具有多样性,动物机体和种族的差异性导致潜伏期不同,犬瘟热毒株为适应宿主机体不断变异,导致犬瘟热在治疗与防控方面面临较大挑战。前尚无治疗犬瘟热的特效药,研究新型的抗病毒药有望用于治疗犬瘟热病。来氟米特是一种在临床上用于治疗成人类风湿性关节炎(RA)等自身免疫性疾病和用于控制器官移植排斥反应的免疫抑制剂。其活性代谢产物A77 1726能抑制嘧啶核苷酸的合成,抑制蛋白酪氨酸激酶和S6K1激酶的活性。来氟米特分子量小,易于合成,价格便宜。近年来研究发现,A77 1726具有多种抗病毒活性,如通过靶向DHO-DHase(二氢乳清酸脱氢酶)影响单核苷酸合成而发挥其抗多瘤病毒和抗轮状病毒作用。另外一些研究发现,来氟米特抑制CMV(巨细胞病毒)和EBV(人疱疹病毒)的活性与抑制单核苷酸的活性无关。A77 1726能否抗犬瘟热病毒尚未有报道。本研究旨在探讨A77 1726是否能抑制CDV复制以及其分子机制。A77 1726处理体外感染犬瘟热病毒疫苗株CDV-Rockborn和强毒分离株CDV-1的Vero细胞,通过Western blot与TCID50实验技术分别检测病毒蛋白N和M的表达水平以及培养上清中的病毒滴度表达水平。结果显示病毒蛋白N和M表达水平与病毒滴度在A77 1726作用下呈浓度依赖性降低,在细胞培养中补加外源性尿苷后,A77 1726丧失抑制病毒复制的能力。Brequinarsodium(BQR)作为DHO-DHase的特异性抑制,单独处理导致病毒蛋白M和N表达水平下降,补加外源性尿苷后,BQR丧失抑制病毒复制的能力。这些结果表明A77 1726通过抑制核苷酸合成来抑制CDV复制。前期发现S6K1能通过磷酸化CAD蛋白(胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶)促进嘧啶碱基单核苷酸合成。我们进一步研究了 A77 1726是否也能通过抑制S6K1酶活性来抑制CDV复制。我们首先分析了 A77 1726在Vero细胞中S6K1激酶活性并诱导PI-3激酶信号通路反馈性激活的情况。结果显示A77 1726处理细胞导致AKT和S6K1磷酸化水平呈浓度依赖性上调,4E-BP、S6和ERK磷酸化水平下调。敲除S6K1基因后显著降低细胞培养上清中的病毒滴度和细胞裂解液中的病毒蛋白水平,并导致A77 1726抑制病毒复制的能力进一步加强。S6K1激酶特异性抑制剂PF-4708671和其上游mTOR激酶抑制剂Rapamycin(雷帕霉素)处理CDV-Rockborn感染的Vero细胞,两者均能有效抑制病毒蛋白合成,降低培养上清中的病毒滴度。PF-4708671和Rapamycin均调控S6K1下游的S6和4E-BP底物蛋白磷酸化,增加AKT磷酸化水平。PF-4708671增加S6K1蛋白磷酸化水平,而Rapamycin则降低S6K1磷酸化水平。A771726是一个多靶点抑制剂,除了抑制S6K1和DHO-DHase活性外,它还能抑制多种酪氨酸激酶活性。在此我们研究了 A77 1726是否通过靶向酪氨酸激酶发挥抗病毒作用。Src家族酪氨酸激酶抑制剂SU6656和JAK酪氨酸激酶抑制剂Rux(Ruxolitinib)处理CDV感染的Vero细胞,结果发现这两个抑制剂对病毒蛋白表达水平没有影响。综上所述,本研究发现A77 1726抑制犬瘟热病毒蛋白的合成和病毒复制。机理研究发现A77 1726通过抑制DHO-DHase酶活性从而抑制胞嘧啶单核苷酸的合成,导致病毒复制受阻。此外,A77 1726抑制S6K1靶点并影响下游CAD酶活性,从而间接抑制单核苷酸的合成。A77 1726的抗病毒活性与其酪氨酸激酶活性无关。本研究为在动物体内试验验证来氟米特对犬瘟的治疗效果和与其它抗体联合治疗是有具有协同抗病毒作用提供理论依据。