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研究目的本研究基于课题组研究基础,确定归芪白术方治疗胃癌（gastric cancer,GC）的潜在作用靶点。利用化学信息学-分子对接-微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）-分子动力学（molecular dynamics,MD）模拟和细胞生物学实验揭示归芪白术方通过“多点显效、协同增效”治疗GC的物质基础和分子机制。研究方法1.基于血管内皮生长因子受体2（vascular epidermal growth factor receptor 2,VEGFR-2）和细胞间充质-上皮转化因子（cellular mesenchymal-epithelial transition factor,c-Met）揭示归芪白术方治疗GC的潜在物质基础1.1基于分子对接技术揭示归芪白术方治疗GC的物质基础:根据文献确定相关靶蛋白的晶体结构和活性位点,利用Schrodinger 10.1对接软件进行归芪白术方小分子与靶蛋白的分子对接。根据分子对接结果结合分子特征筛选归芪白术方代表性小分子,MST实验检测代表性小分子与靶蛋白的体外亲和力。分子毒性预测、细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8,CCK8）实验和MD模拟技术被用于验证代表性小分子的毒性及体外活性并确定归芪白术方代表性小分子种类。1.2细胞生物学方法验证归芪白术方代表性小分子的活性:蛋白质免疫印迹（western blot,WB）实验筛选靶点蛋白高表达的GC细胞株。CCK8实验、克隆形成实验、三维（three dimensions,3D）肿瘤微球实验和WB实验验证归芪白术方代表性小分子抑制GC细胞增殖能力;流式细胞术（flow cytometry,FCM）、Hoechst 33342染色、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）检测和WB实验验证归芪白术方代表性小分子对GC细胞周期和凋亡的影响;Transwell迁移、侵袭实验和WB实验检测归芪白术方代表性小分子对GC细胞迁移、侵袭和上皮细胞间质转化（epithelial interstitial transformation,EMT）的影响;酶活实验检测归芪白术方代表性小分子对靶点蛋白激酶的抑制作用;实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）和WB实验揭示归芪白术方代表性小分子抑制GC细胞增殖的可能作用机制。2.Transwell共培养体系探讨归芪白术方代表性小分子联合用药的效果分离、提取并鉴定脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）,并与靶点蛋白高表达GC细胞株建立共培养体系,CCK8法、RT-q PCR法和WB实验评价共培养模型。适宜浓度归芪白术方代表性小分子单独或联合干预共培养的胃癌细胞,FCM、Transwell迁移、侵袭实验和WB实验检测共培养体系对共培养GC细胞周期、迁移和侵袭能力的影响及HUVEC周期和血管生成的影响;WB实验检测信号通路相关蛋白的表达。CCK8法、FCM、Transwell迁移、侵袭实验和WB实验验证归芪白术方代表性小分子对共培养条件下GC细胞的抑制作用及可能的机制。研究结果1.基于VEGFR-2和c-Met揭示归芪白术方治疗GC的潜在物质基础1.1分子对接技术揭示归芪白术方治疗GC的物质基础:分子对接结果显示归芪白术方中有156个中药小分子与VEGFR-2蛋白对接打分分值≤-7.36,这些分子主要来自甘草、大黄、当归和黄芪,有131个中药小分子与c-Met蛋白对接打分分值≤-8.20,主要来自甘草、大黄和黄芪。分别从打分排名前20位的分子中选定7个靶向VEGFR-2的小分子和4个靶向c-Met的小分子进行MST验证,结果显示大黄酸与VEGFR-2的亲和力Kd值为15.88μM,其次是甘草黄酮A（licoflavone A,LA）,Kd值为25.99μM;芦丁与c-Met的结合亲和力Kd值为0.28μM,其次是川陈皮素（nobiletin,NOB）,Kd值为0.71μM。小分子毒性预测结果显示11个分子都没有肝毒性。CCK8实验结果显示7个靶向VEGFR-2的分子中,LA和芦荟大黄素对三株GC细胞株的抑制能力最好,呈时间和剂量依赖,4个靶向c-Met的分子中,NOB对三株GC细胞株的抑制能力最好,呈时间和剂量依赖。结合MST结果选择LA和NOB继续进行MD模拟,结果显示LA与VEGFR-2有很好的亲和力且结合稳定,NOB与c-Met具有很好的亲和力且结合稳定。1.2细胞生物学实验验证归芪白方代表性小分子的体外抗肿瘤活性:由于NOB的抗肿瘤作用已被广泛报道,但LA是否有抗肿瘤作用之前未见报道,所以进一步基于细胞实验验证LA的抗肿瘤作用。用25、50和100μM的LA干预20 ng/m L VEGF刺激的MKN-45细胞,结果显示LA以剂量依赖性的方式抑制VEGF刺激的MKN-45细胞增殖、周期、凋亡、迁移、侵袭和EMT,差异有统计学意义。酪氨酸激酶实验结果显示LA对VEGFR-2的半数抑制浓度IC50是14.36μM。并且通过降低磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）m RNA的表达以及丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（mitogen-activated extracellular signal regulated kinase,MEK）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）蛋白的磷酸化水平,发挥抗GC的作用。2.共培养体系中探讨归芪白术方代表性分子对GC细胞增殖的影响对共培养体系进行评价,发现共培养体系存在VEGFR-2和c-Met的互作,与MKN-45细胞相比,表现为共培养的MKN-45细胞VEGF m RNA表达增高,与HUVEC相比,共培养的HUVEC HGF m RNA表达增高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。共培养的MKN-45细胞和HUVEC与单培养的同种细胞相比VEGFR-2和c-Met蛋白的磷酸化水平上升,差异有统计学意义（P＜0.01）,出现这种现象的机制与PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路激活有关。分别用25μM Apatinib、25μM LA和25μM NOB干预共培养的MKN-45细胞,结果显示与control组相比,Apatinib、LA和NOB均能显著抑制共培养的MKN-45细胞增殖、周期、迁移和侵袭,二者或者三者联合效果优于单用药组,其机制与靶向VEGFR-2和c-Met,抑制下游PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路有关。结论1.分子对接方法分析发现归芪白术方发挥治疗GC作用的成分主要来自甘草、大黄、当归和黄芪,出自该方的君、臣、佐、使,符合该方健脾和胃、补益气血兼活血化瘀的主功效,从大数据角度初步揭示了归芪白术方治疗GC的物质基础,充分体现了该方“多点显效,协同增效”的作用。2.化学信息学方法、文献研究和细胞生物学实验揭示LA和NOB的抗肿瘤作用及可能的机制,证实归芪白术方潜在抗胃癌作用,揭示归芪白术方通过健脾化瘀法治疗胃癌的科学内涵,为归芪白术方的开发与转化提供依据,同时为中药复方的现代化研究提供方法学参考。