目的:研究表明,自噬可能是一种新的自我适应机制,通过减少释放基质小泡,自噬可以降低磷酸盐引起的血管钙化。此外,阿伐他汀通过抑制β-catenin信号通路引起自噬,从而降低转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)引起的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)钙化。血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)能够诱导自噬发生,降解收缩蛋白,调控VSMCs由收缩型转变为增殖型,增加了氧化应激时细胞的生存能力。然而,PDGF-BB诱导的VSMC自噬与血管钙化的关系尚不清楚,因此本实验利用PDGF-BB刺激VSMCs不同时间,探讨VSMC自噬与血管钙化的相关性及其作用机制。方法:1 VSMC培养选取80-100 g雄性SD大鼠(清洁级),贴块法分离胸腹主动脉培养于含10%FBS的DMEM培养基中。待细胞生长至70-80%汇合后,0.25%胰蛋白酶消化传代,取3-5代细胞进行实验。2 Western blot分析取等量的蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),半干法将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜上。以5%的脱脂奶粉37℃封闭2 h。加入一抗4℃过夜,TBST洗膜后以HPR标记的Ig G二抗37℃封闭2 h,TBST洗膜后,ECL化学发光成像。3免疫荧光染色分析处理后的细胞用4%多聚甲醛固定15 min,1%Triton X-100处理15min,10%山羊血清室温封闭30 min后,分别加入兔抗Beclin1多克隆抗体与兔抗LC3多克隆抗体,4℃孵育过夜。经PBS充分漂洗后,加入Alexa Fluor 555标记的羊抗兔荧光二抗室温孵育,激光共聚焦显微镜下观察。4免疫共沉淀分析处理后的细胞溶解于缓冲液(50 mMTris-HCl,pH 7.6,150 m M Na Cl,1%NP-40,10 m M磷酸二氢钠,10 m M Na F,2 m M PMSF)中,4℃离心后,吸取上清,分别加入Beclin1抗体或PI3KC3抗体,然后加入Protein A–agarose 4℃过夜,洗涤后,收集Protein A-抗原-抗体复合物进行Western blot检测。结果:1 PDGF-BB刺激VSMCs不同时间对钙化标志物表达的影响PDGF-BB(10 ng/mL)刺激VSMCs不同时间(6、12、24、48、72 h),同时设不含刺激物的阴性对照组。Western blot分析检测血管钙化相关蛋白BMP2与ALP的表达。结果显示,BMP2与ALP的表达随刺激时间不同而变化,呈先降低后增高的趋势,ALP在12 h达到低谷,BMP2在6 h达到低谷。2 PDGF-BB刺激VSMCs不同时间对自噬标志物表达的影响PDGF-BB刺激VSMCs不同时间(6、12、24、48、72 h),Western blot分析检测自噬相关蛋白Beclin1与LC3的表达,其中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化率增加表明自噬活动增强,它被认为是一个可靠的自噬体形成标志。结果显示,Beclin1的表达随刺激时间不同而变化,呈先增高后降低的趋势,且在12 h达到高峰。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化呈时间依赖性增强,并在48 h时达到高峰,随后降低。细胞免疫荧光染色结果亦显示,与对照组相比,PDGF-BB刺激12 h后,LC3与Beclin1的表达均显著增强。3自噬抑制剂3-MA对PDGF-BB诱导VSMC钙化的影响3-MA(10 m M)预孵育VSMCs 2 h后,PDGF-BB刺激12 h,Western blot分析检测自噬相关蛋白Beclin1与LC3的表达,结果显示,3-MA明显降低PDGF-BB诱导的Beclin1与LC3的表达。免疫荧光染色也显示类似结果,与PDGF-BB刺激组相比,3-MA/PDGF-BB刺激组的细胞中Beclin1与LC3的表达明显减弱。随后,观察3-MA对血管钙化相关蛋白BMP2与ALP表达的影响。Western blot结果显示,与PDGF-BB刺激组相比,3-MA预孵育的PDGF-BB刺激组中BMP2与ALP的表达明显增高。4 PDGF-BB对Beclin1与PI3KC3相互作用以及Beclin1磷酸化的影响PDGF-BB刺激VSMCs不同时间(0、6、12、24 h),细胞裂解液分别用Beclin1抗体与PI3KC3抗体进行交互免疫共沉淀分析,结果显示,随着刺激时间的延长,Beclin1与PI3KC3的相互作用逐渐增强,12 h达到高峰,24 h仍维持较高水平。然后,细胞裂解液用抗p-Ser抗体进行免疫沉淀后,用抗Beclin1抗体检测磷酸化的Beclin1水平,结果显示,PDGF-BB处理VSMCs后,Beclin1磷酸化水平增高,6 h达到高峰,12 h仍维持较高水平。结论:1 PDGF-BB刺激早期抑制VSMC钙化,晚期促进VSMC钙化。2 PDGF-BB诱导的VSMC自噬被3-MA抑制后,VSMC钙化加剧。3 PDGF-BB通过诱导Beclin1磷酸化以及PI3KC3与Beclin1相互作用,促进VSMC自噬。