明确的分子特征信息和特异性的检测技术是转基因作物商业化和市场监管的关键因素,同时分子特征又是实现转基因作物特异性检测的基础。为了发展更好、更全面的分子特征鉴定技术,本研究针对单或低拷贝数外源基因插入,建立了不依赖限制性内切酶的随机片段破碎基因组步移技术;针对随机多拷贝插入的转基因作物,如基因枪转化法等,建立了二代测序结合生物信息学分子特征鉴定技术。同时根据获得的分子特征信息,将转基因作物侧翼序列与多重PCR检测技术结合,建立了两种高效、灵敏的转基因作物多重定性定量检测方法,本文主要研究内容和结论总结如下:1,建立随机片段破碎基因组步移技术,该技术不依赖限制性内切酶对基因组进行随机片段化;开发的5’定向接头有效避免接头之间自连,提高PCR扩增特异性;方法所用步骤都是分子生物学基本技术,简单易行。以转基因玉米LY038为研究对象,利用转基因作物的左、右边界信息来扩增侧翼序列。结果表明,随机片段破碎基因组步移技术有较高的特异性和可靠性,只需通过一次实验流程即可获得未知序列,可以应用于单拷贝或低拷贝插入的转基因作物侧翼序列分离以及基因步移的其他应用方面。2,利用二代测序结合生物信息学,建立基因枪法转基因作物分子特征鉴定技术。根据外源插入基因等参照序列的已知情况建立两种数据分析方式,并且分析不同测序深度获得的分子特征情况。以转基因玉米Bt176为研究对象,利用该方法获得13个外源基因插入位点和侧翼序列,打破Bt176一个插入位点的共识。利用该方法在分析转基因作物分子特征时,测序深度至少在30×以上;如测序数据用于复杂转基因作物样品检测,15×测序深度即可确认转基因作物品系。研究结果表明,该技术是一种高效、准确的分子特征鉴定手段,为基因枪法转化的转基因作物分子特征鉴定开辟新途径,并为其安全性评价、非期望效应分析和商业化提供数据支持。3,建立通用单引物多重连接依赖探针扩增技术,通过改造连接探针结构,使上下游连接探针都含有相同的共同序列,降低反应体系复杂程度,并保留方法高度特异性。结合高分辨率测序凝胶电泳,实现扩增产物高效分离。采用新建立的多重检测方法,成功实现转基因作物MON810、MON863和GTS 40-3-2品系特异性、筛选基因、内标准基因等7重检测,检测灵敏度为0.1ng。此外,对连接探针填充片段长度的研究结果表明,填充片段的长短对连接和扩增反应无显著影响,为继续增加多重反应所检测的目的基因数量提供可能。4,以焦磷酸测序为检测手段,建立转基因作物通用引物多重PCR结合焦磷酸测序定性定量检测技术,仅利用一条测序引物,即可实现多重PCR产物同时检测。利用数学矩阵和计算机编程,根据焦磷酸测序原理编写碱基序列简并和测序结果计算软件,实现转基因作物多重定量检测。本检测方法,不需借助电泳等分离方式,在PCR扩增时也无须使用探针和荧光标记,节约成本和检测时间,为转基因作物的多重定量检测提供新的技术支持。本研究所建立的转基因作物分子特征鉴定新技术和多重PCR检测新方法为转基因作物的安性评价、定性定量筛查和检测提供了有力的技术支持,也为其他相关领域的研究提供新的方法和思路。