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外泌体(Exosomes)是一类具有双层膜结构的胞外小囊泡,富含miRNAs,mRNAs和蛋白质等,主要负责细胞间的物质运输和信息传递。人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)来源的外泌体具有促进血管生成的能力。在本研究中,间充质干细胞接受时间可控、强度可控的光照刺激处理后进行增殖、迁移及血管新生能力检测分析。实验结果表明:455 nm单色蓝光以300μW/cm2强度照射120min可促进间充质干细胞的增殖及迁移。进一步将其与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养之后,发现特征蓝光显著促进内皮细胞的增殖、迁移及血管新生,其中外泌体中miR-135b-5p和miR-499a-3p在此过程发挥重要调控作用。[研究目的]本研究对特征蓝光促进干细胞外泌体的促血管生成能力进行探索,并对其中初步的分子机制进行分析。[研究方法]1、光照刺激细胞:分别选用单色蓝光(455 nm)和红光(638 nm)处理来研究单色可见光对MSCs及HUVECs细胞行为的影响。2、细胞增殖、迁移及血管新生检测:利用EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)掺入、划痕和血管形成实验分别对MSCs以及共培养下HUVECs的增殖、迁移、血管新生能力进行检测。3、基质胶塞模型检测蓝光刺激MSCs促血管新生能力:向小鼠皮下腹股沟位置注射适量混有外泌体的基质胶,形成栓塞后取出进行苏木素-伊红染色及免疫荧光染色分析。4、小鼠烧烫伤模型检测蓝光刺激MSCs外泌体促血管新生能力:沸水在小鼠背部形成直径约1 cm的烫伤皮肤区域构建烧烫伤模型,检测MSCs外泌体的治疗效果。分别在处理0、3、5、7天后对皮肤组织进行苏木素-伊红染色及免疫荧光染色分析。5、MSCs来源外泌体的提取、分离和鉴定:收集MSCs的培养基上清液,利用QIAGEN exoEasy Maxi试剂盒分离外泌体,透射电镜和特征表面抗体鉴定外泌体。6、测定细胞及外泌体中miRNAs的表达水平:TRIzol法分别提取细胞及外泌体中的 miRNAs,利用 Real-Time PCR 检测 miR-135b-5p 和 miR-499a-3p 表达水平。[实验结果]1、MSCs表达RHO,RRH,OPN1SW,OPN4和OPN5等多种光敏感蛋白。2、455 nm单色蓝光以300μW/cm2强度照射120 min可增强与MSCs共培养的HUVECs的增殖、迁移和血管形成能力。3、特征蓝光处理MSCs外泌体可促进基质胶塞中HUVECs的浸润及血管生成。4、特征蓝光处理的MSCs外泌体可促进烧烫伤模型中伤口部位HUVECs的血管生成,有益于伤口愈合。5、特征蓝光处理提高MSCs外泌体中miR-135b-5p和miR-499a-3p表达水平,抑制靶基因MEF2C表达。[结论]研究发现455 nm单色蓝光以300 μW/cm2强度照射120 min可有效提高MSCs外泌体的促血管生成能力。特征蓝光处理的MSCs外泌体中miR-135b-5p和miR-499a-3p表达增加,促进共培养体系中HUVECs的增殖,迁移和血管形成,对组织再生和修复提供了科学线索。