利用酵母双杂交筛选及鉴定稻瘟菌E3泛素连接酶调节亚基Mogrr1的互作蛋白

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wanghuayu1985
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由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引发的稻瘟病每年给世界粮食作物生产带来重大损失。该病害在水稻整个生育期均有发生,症状遍布水稻各个部位,也被称为“水稻癌症”,一直是世界稻区上分布最广、危害程度最重的病害之一。稻瘟病菌的完整基因组数据公布,为人类从分子生物学角度进一步探究稻瘟病菌的致病机理,以及给相关致病基因的研究提供理论依据,进而为科学防治稻瘟病奠定基础。泛素蛋白酶体途径通过泛素蛋白和三种泛素酶的共同作用,以清除真核生物机体部分异常蛋白,从而广泛参与真核生物的细胞周期、基因表达、转录调节、信号传递、免疫等一系列重要生理过程。在三种泛素酶中,E3泛素连接酶负责识别靶蛋白,并将其与泛素蛋白连接,它在泛素化过程中扮演重要角色。在实验室前期工作中,发现E3泛素连接酶亚基Mogrr1是调节稻瘟病菌生长发育及致病的重要因子。为深入解析Mogrr1调控稻瘟病菌生长及致病的分子机制,本研究以Mogrr1蛋白为诱饵,利用酵母双杂交筛选技术,在稻瘟病菌菌丝阶段cDNA酵母文库中对Mogrr1的互作蛋白进行了筛选。结果表明,从稻瘟菌的cDNA文库中初步筛选到28个可能与Mogrr1互作的蛋白,进一步利用酵母双杂交对初筛结果进行一对一的质粒共转验证,确定 Mogrr1 与 MoPP2Ac(MGG06099)、Mouga1(MGG01662)存在强相互作用,而与 Moppe1(MGG03911)、MoPP2Ab(MGG05637)存在弱相互作用。此外,构建MoPP2Ac的猎物载体,将它与Moppe1、MoPP2Ab、Mouga1的诱饵载体分别共转酵母AH109,结果表明MoPP2Ac与Moppe1、MoPP2Ab、Mouga1之间亦存在相互作用。此外试验还分别缺失Mogrr1的F-box结构域和LRR结构域,利用酵母双杂交的方法检测,发现当单独缺失F-box结构域时,Mogrr1与MoPP2Ac、Moppe1不再互作,而当单独缺失LRR结构域时,不影响Mogrr1与MoPP2Ac、Moppe1之间的互作。综上述,本研究借助酵母双杂交方法,获得了 MoPP2Ac、Moppe1、MoPP2Ab、Mouga1共4个与Mogrr1相互作用的蛋白,并且通过一对一质粒共转实验,揭示了MoPP2Ac与Moppe1、MoPP2Ab、Mouga1的互作关系,同时实验明确了 F-box是影响Mogrr1与MoPP2Ac、Moppe1互作的关键结构域,为后续筛选鉴定Mogrr1的互作蛋白以及揭示Mogrr1的分子作用机制打下了良好基础。
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